陳 陽，金一鋒，金忠民，王玉書，蔡榮建，邵竹林，王 杰

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

氮素是影響草坪生長及觀賞價值的重要因素，如何提高氮素利用率是草坪領(lǐng)域急需解決的重點。硝態(tài)氮是植物生長發(fā)育的主要氮素來源，硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白主要作用于吸收硝態(tài)氮，調(diào)節(jié)氮素的吸收、同化與再利用[1]。植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要涉及3個不同的基因家族，包括硝酸鹽轉(zhuǎn)運體NRT2s、硝酸鹽轉(zhuǎn)運體/肽轉(zhuǎn)運體NRT1/PTR FAMILY、硝酸鹽同化相關(guān)基因NAR2s[2]。高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白主要由NRT2家族編碼，在外源硝態(tài)氮濃度較低時發(fā)揮作用。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativaL.)的研究中發(fā)現(xiàn)，部分高親和硝酸鹽運輸?shù)鞍譔RT2需要與NARs(Nitrate assimilation related genes)共同完成運輸硝酸鹽的過程[3]，AtNRT2.1和AtNAR2.3有互作，OsNAR2.1與OsNRT2.1、OsNRT2.2硝酸鹽轉(zhuǎn)運體相互作用，在不同濃度氮素條件下均起作用[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)，NRT2家族基因從氮庫通過韌皮部向新生組織或者器官運輸過程中發(fā)揮一定作用，擬南芥韌皮部負載2種硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白AtNRT2.4和AtNRT2.5，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)氮素充足時AtNRT2.4主要表達于葉主脈的韌皮部或韌皮部薄壁組織中，當?shù)囸I時擬南芥可以從質(zhì)外體中重新吸收硝酸鹽，使氮素向篩管成分和伴生細胞中移動[6]。AtNRT2.5在擬南芥的葉部中表達，其細胞定位尚不清楚，可與AtNRT2.4協(xié)同作用于韌皮部的硝酸鹽運輸過程[6]。禾本科草種NRT2家族基因的相關(guān)研究，主要集中于二穗短柄草BdNRT2家族基因，Wang等[7]對多個二穗短柄草(Brachypodium distachyon)NRT2家族基因進行鑒定，發(fā)現(xiàn)氮源及氮素濃度均影響B(tài)dNRT2家族基因的表達水平。克隆并鑒定草地早熟禾NRT2家族基因的功能，利于了解草地早熟禾硝酸鹽轉(zhuǎn)運機制。本研究以草地早熟禾為材料，克隆硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT2.4基因，并進行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、同源進化關(guān)系等生物信息學(xué)分析，利用實時熒光定量PCR進行NRT2.4基因組織特異性及氮素誘導(dǎo)下的表達機制，為后續(xù)其功能驗證奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為草地早熟禾午夜2號品種，將材料放于光照培養(yǎng)箱中，參數(shù)設(shè)置為：溫度為24 ℃/15 ℃(晝/夜)，光照時長為13 h/11 h(晝/夜)，光照強度500 μmol/(m2·s)，相對濕度60%。本研究選取培養(yǎng)3個月以上的健康植株進行后續(xù)試驗。

1.2 草地早熟禾RNA的提取與cDNA的合成

選取健康草地早熟禾植株，利用天根植物總RNA的提取試劑盒提取植物總RNA。采用微量分光光度計Nanodrop 測定RNA濃度與純度，并通過瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA完整性，待RNA合格后置于-80 ℃保存。以植物總RNA為模板，利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA第1條鏈的合成，具體步驟參照相關(guān)試劑盒，完成后將其放于-80 ℃長期保存。

1.3 草地早熟禾NRT2.4基因編碼區(qū)的克隆

根據(jù)NCBI GenBank已公布二穗短柄草NRT2.4(XM_003566718.4)及本研究前期二代轉(zhuǎn)錄組測序得到的草地早熟禾mRNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異性引物，NRT2.4-F: 5′-TTGGCTAGCTACTACCAGCCT AG-3′，NRT2.4-R: 5′-CCAACACACTTCCATATGTAG GAAGT-3′，以草地早熟禾cDNA為模板RT-PCR擴增獲得NRT2.4基因ORF序列。

1.4 草地早熟禾NRT2.4基因生物信息學(xué)分析

利用ProtParam 在線分析草地早熟禾NRT2.4氨基酸理化性質(zhì)；利用TMHmmol/LServer 在線分析編碼氨基酸的跨膜區(qū)；利用SignalP 4.1 分析信號肽情況；利用NetPhos 3.1 Server 在線分析磷酸化位點；草地早熟禾NRT2.4蛋白二級結(jié)構(gòu)利用SOPMA 在線分析，三級結(jié)構(gòu)利用SWISS-MODE在線分析；利用CDD預(yù)測草地早熟禾NRT2.4編碼氨基酸的典型結(jié)構(gòu)域，相關(guān)蛋白的保守基序分析使用MEME (http://meme.sdsc.edu)進行。

1.5 實時熒光定量PCR分析

選取長勢一致的植株，將其根部置于1/2 Hoagland水培液中，待培養(yǎng)14 d后進行氮素處理。將植株置于相同氮素濃度不同氮源 (A: NaNO3,B:(NH4)2SO4,C: NH4NO3)培養(yǎng)液，14 d后取樣。以NaNO3為氮源配置不同濃度(0，1.5，7.5，15.0 mmol/L)培養(yǎng)液，14 d后取樣。以上氮素水培處理植物的取材部位均為葉部，每個處理 3 次生物學(xué)重復(fù)。采用qRT-PCR的相對定量方法，根據(jù)克隆獲得NRT2.4基因序列設(shè)計引物，Q-NRT2.4-F：5′-ATGGGCCCC GTTTGCGACC-3′，Q-NRT2.4-R：5′-CGGGACATCCA GTGCTGGTT-3′，利用2-ΔΔCt法處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾NRT2.4基因編碼區(qū)的獲得

利用特異性引物NRT2.4-F/NRT2.4-R，通過RT-PCR擴增出條帶(圖1)，經(jīng)NCBI分析表明，克隆獲得草地早熟禾NRT2.4基因1 694 bp，其中1 257 bp為開放閱讀框(ORF)，編碼418個氨基酸序列(圖2)。

2.2 草地早熟禾NRT2.4基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1NRT2.4基因編碼氨基酸序列分析 用ProtParam對草地早熟禾NRT2.4蛋白的理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示：其分子量為43.75 ku，等電點(pI)為8.87，蛋白質(zhì)分子式為C1977H3089N533O529S30，為穩(wěn)定蛋白。NRT2.4編碼氨基酸組成見表1，其中含量較高的是Ala，占17.9%。其中，表面帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)有23個，帶正電荷的氨基酸殘基 (Arg+Lys)有32個，平均親水系數(shù)為0.609。

表1 草地早熟禾NRT2.4編碼氨基酸組成Tab.1 The amino acid composition of NRT2.4 in Kentucky bluegrass %

利用TMHmmol/L Server v. 2.0在線分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾NRT2.4蛋白具有8個跨膜區(qū)。由圖4可見，草地早熟禾NRT2.4編碼氨基酸的平均信號肽最大值為0.131，未超過其閾值0.5，推斷出該蛋白無信號肽。利用Expasy-protscale軟件分析，該蛋白屬于親水性蛋白(圖5)。由圖6可見，草地早熟禾NRT2.4蛋白序列潛在的磷酸化位點包括Serine(17個)、Threonine(9個)、Tyrosine(1個)。

2.2.2 草地早熟禾NRT2.4蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 經(jīng)SOPMA對NRT2.4蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，如圖7所示，草地早熟禾NRT2.4蛋白其含有51.67%的α-螺旋、28.71%的不規(guī)則卷曲、14.11%的延伸鏈和5.50%的β-轉(zhuǎn)角 (圖7)。進一步利用SWISS-MODEL在線軟件對NRT2.4基因編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)進行建模(圖8)，三級結(jié)構(gòu)與NRT2.4蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相似。

2.3 NRT2.4基因在不同組織部位及氮素處理中的表達特異性分析

2.3.1 草地早熟禾NRT2.4基因組織表達模式 本研究利用qRT-PCR方法測定草地早熟禾NRT2.4基因在不同組織中相對表達量，如圖12-A可見，葉部NRT2.4相對表達量顯著高于根部和莖部，NRT2.4基因表達水平存在組織特異性。

3 討論與結(jié)論

植物NRT2家族成員主要參與以硝酸鹽為底物進行吸收與轉(zhuǎn)運過程[8-9]。二穗短柄草、擬南芥NRT2家族基因組織特異性相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，二穗短柄草NRT2家族基因在不同組織中的表達水平存在一定差異，BdNRT2.3和BdNRT2.4基因在葉部高度表達，BdNRT2.5基因在小穗中高度表達，而BdNRT2.6在二穗短柄草不同組織中表達量均較低[10]。擬南芥AtNRT2家族基因在葉部的表達存在一定差異，AtNRT2.4和AtNRT2.5在葉部高度表達，但AtNRT2.6和AtNRT2.7表達量較低[11-12]。甘藍型油菜(Brassica napusL.)高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT2家族基因分析及其對逆境的響應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，BnNRT2.1、BnNRT2.2a和BnNRT2.4a在根組織中表達量較高，而BnNRT2.7a和BnNRT2.7b主要在地上部分表達[13]。可見，同物種不同NRT2家族基因在組織中的表達水平存在一定差異。本研究中草地早熟禾NRT2.4基因在葉部表達量最高，其組織特異性趨勢與二穗短柄草BdNRT2.4表達趨勢相似。這可能是草地早熟禾與二穗短柄草均為禾本科草種，其特點是地上生長量致密，葉部占整個植株比重較大，所以葉部參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運過程的BdNRT2.4可能起重要作用。

本研究克隆獲得草地早熟禾硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT2.4基因，開放閱讀框序列為1 257 bp，編碼了418個氨基酸序列，含有Nitrate transmembrane transporter和Nitrite extursion protein結(jié)構(gòu)域，屬于Nitrate/nitrite transporter NarK超級家族，與二穗短柄草、節(jié)節(jié)麥的NRT2.4氨基酸序列同源性最高。草地早熟禾NRT2.4基因在葉部表達量較高，氮饑餓和高濃度NaNO3水培液處理均利于NRT2.4基因的表達。草地早熟禾NRT2.4基因克隆與表達分析有利于進一步驗證硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT2家族基因的功能。