高天一，郝芳敏，臧全宇，馬二磊，黃蕓萍，王毓洪

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

甜瓜蔓枯病(Gummy stem blight，GSB)是目前全球范圍內(nèi)重要的真菌病害，其病原菌為Stagonosporopsis cucurbitacearum。該病主要通過土壤進(jìn)行傳播，莖蔓和葉片是最主要的發(fā)病部位，該病發(fā)病極快，一旦發(fā)生很難控制，嚴(yán)重影響瓜類的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了我國(guó)瓜類產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。選育抗病品種是防治蔓枯病最有效的途徑，但由于蔓枯病抗性遺傳機(jī)制復(fù)雜，缺乏高抗病的種質(zhì)資源，通過常規(guī)育種手段選育抗病品種存在耗時(shí)長(zhǎng)、效果差等問題[2]。因此，明確甜瓜蔓枯病抗病基因?qū)μ鸸下莶】共∮N工作具有重要的意義。

SLAF-Seq(Specific length amplified fragment se-quencing)技術(shù)是一種簡(jiǎn)化的高通量測(cè)序技術(shù)，其具有效率高、成本低、數(shù)量豐富、周期短等優(yōu)勢(shì)，該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建高密度遺傳圖譜、高通量分子標(biāo)記開發(fā)、群體進(jìn)化分析及目標(biāo)性狀的基因定位等方面[3]。QTL(Quantitative trait locus)定位研究為開展分子抗病育種提供了基因資源，國(guó)內(nèi)外已有眾多學(xué)者利用SLAF-Seq技術(shù)結(jié)合BSA(Bulked Segregant Analysis)的方法，在不同的植物上獲得了與目標(biāo)性狀顯著相關(guān)的候選基因和分子標(biāo)記。該技術(shù)在包括擬南芥疫霉病[4]、小麥條銹病[5]、玉米大斑病[6]、蘋果銹病[7]、黃瓜白粉病[8]、煙草花葉病[9]等許多病害上得到應(yīng)用。近年來(lái)甜瓜全基因組測(cè)序的完成為研究甜瓜相關(guān)性狀的遺傳機(jī)制奠定了生物信息學(xué)的基礎(chǔ)，張紅等[10]采用SLAF-seq技術(shù)結(jié)合BSA的方法，結(jié)合甜瓜全基因組參考序列，在甜瓜中獲得了與甜味和酸味性狀相關(guān)的基因區(qū)域，精細(xì)定位了1個(gè)與甜瓜含糖量相關(guān)基因和3個(gè)酸度性狀相關(guān)基因。

甜瓜蔓枯病抗性遺傳機(jī)制十分復(fù)雜，目前甜瓜對(duì)蔓枯病的抗性遺傳規(guī)律還不是非常明確。通過甜瓜抗感材料雜交后代性狀分離的方法，在甜瓜上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與蔓枯病抗性相關(guān)的基因，包括gsb1、gsb2、gsb3、gsb4和gsb5等[11-13]，但目前并未分析這些基因在甜瓜染色體的定位和相關(guān)基因功能，因此明確甜瓜蔓枯病抗性基因的定位對(duì)甜瓜蔓枯病抗病育種工作有重要的作用。本研究以甜瓜蔓枯病抗病材料P181和感病材料P01為親本，基于其F2單株接種蔓枯病菌后鑒定結(jié)果，分別構(gòu)建F2極端抗病池和感病池，并利用SLAF-seq和BSA技術(shù)對(duì)蔓枯病抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得GSB主效QTL位點(diǎn)，根據(jù)已公布的甜瓜全基因組序列，結(jié)合QTL區(qū)域內(nèi)候選基因的功能注釋，預(yù)測(cè)與甜瓜蔓枯病抗病相關(guān)的功能基因，為甜瓜蔓枯病相關(guān)基因的精細(xì)定位和抗病育種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以甜瓜高抗蔓枯病材料P181和高感蔓枯病材料P01為雙親本，與其F2分離群體(180株)共同作為試驗(yàn)群體。甜瓜蔓枯病菌菌株編號(hào)14mk020，于2014年在寧波市甜瓜蔓枯病病株中分離并純化，為寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 蔓枯病菌接種及病情指數(shù)分級(jí)

蔓枯病孢子誘導(dǎo)參考張立杰等[14]的方法并略有修改。將蔓枯病菌接種到 PDA培養(yǎng)基活化，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d。隨后挑取菌絲塊在燕麥瓊脂培養(yǎng)基(艾禮生物科技有限公司，上海)上培養(yǎng)7 d，待白色菌落形成后置于紫外光下進(jìn)行孢子囊的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件為紫外時(shí)間/黑暗時(shí)間=12 h/12 h, 誘導(dǎo)4 d后將菌絲上形成的孢子囊用玻璃棒輕輕刮到無(wú)菌水中，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并用蒸餾水將孢子懸浮液終濃度調(diào)節(jié)為1×105個(gè)/mL備用。

待甜瓜苗長(zhǎng)至三葉一心后，采用噴霧接種法對(duì)2個(gè)親本及180株甜瓜F2進(jìn)行蔓枯病菌孢子液接種處理，噴霧至葉片有滴水時(shí)用塑料薄膜覆膜保濕，并放置于人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種4 d后統(tǒng)計(jì)F2發(fā)病情況。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Z(yǔ)hang等[15]的方法，依據(jù)莖蔓病斑發(fā)病程度，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：1級(jí)：無(wú)病斑；2級(jí)：?jiǎn)蝹€(gè)病斑 (1～10 mm) 或幾個(gè)連續(xù)的病斑 (1～20 mm)，但未環(huán)繞莖部一周；3級(jí)：幾個(gè)連續(xù)的病斑 (21～80 mm) 或病斑環(huán)繞莖部一周；4級(jí)：莖部失水萎縮但植株未死亡；5級(jí)：植株死亡。具體如圖1所示。

1.3 SLAF文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

依據(jù)F2蔓枯病抗病性鑒定結(jié)果，選取F2群體中極端抗病的30個(gè)單株和極端感病的30個(gè)單株，按照CTAB方法提取單株DNA，并分別構(gòu)建抗病和感病的DNA混池。利用SLAF技術(shù)對(duì)合格的DNA樣品建庫(kù)測(cè)序，以甜瓜基因組(DHL92)v3.6.1作為參考基因組(http：//www.cucurbitgenomics.org/organism/18)。將各樣品基因組DNA超聲破碎，對(duì)得到的片段依次進(jìn)行3′端加polyA處理、連接測(cè)序接頭、PCR富集、純化去接頭污染，文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)，最后使用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 SLAF-seq 測(cè)序數(shù)據(jù)分析及候選基因的篩選

對(duì)甜瓜參考基因組進(jìn)行酶切，將酶切長(zhǎng)度在264～414 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽，統(tǒng)計(jì)SLAF標(biāo)簽在各染色體的數(shù)量。在親本中搜索多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽和有reads覆蓋區(qū)域的SNP。使用GTAK軟件對(duì)親本與子代混池進(jìn)行SNP開發(fā)，得到SNP位點(diǎn)集，在關(guān)聯(lián)分析前對(duì)SNP進(jìn)行過濾，依次過濾掉有多個(gè)基因型的SNP位點(diǎn)、read支持度小于4的SNP位點(diǎn)、混池間基因型一致的SNP位點(diǎn)及隱性混池基因不是來(lái)自于隱性親本的SNP位點(diǎn)，最終得到高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)。采用SNP-index方法計(jì)算Δ(SNP-index)指數(shù)，取95%置信水平為篩選閾值，對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定位，將置信水平線以上的區(qū)間定為候選區(qū)域。以甜瓜基因組(DHL92)v3.6.1作為參考基因組進(jìn)行基因注釋，利用NR、NT、GO、KEGG和COG等數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)候選區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行功能分析，尋找與甜瓜蔓枯病抗病相關(guān)的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F2蔓枯病抗病性鑒定

在接種后第5天進(jìn)行蔓枯病抗病性鑒定，親本發(fā)病情況如圖2所示，抗病甜瓜親本P181接種蔓枯病菌后部分葉片略有黃化，出現(xiàn)輕微褐色病斑。感病甜瓜親本P01接種蔓枯病菌后發(fā)病嚴(yán)重，葉片萎蔫，莖部腐爛，整株枯死。

F2發(fā)病情況如圖3所示，在180株F2群體中，發(fā)病等級(jí)為1的甜瓜幼苗有40株，等級(jí)為2的幼苗有44株，等級(jí)為3的幼苗有45株，等級(jí)為4的幼苗有35株，等級(jí)為5的幼苗有16株。F2群體蔓枯病抗病性狀整體呈現(xiàn)連續(xù)分布，表明抗病親本為數(shù)量遺傳性狀，能夠進(jìn)行QTL分析。

2.2 SLAF 標(biāo)記開發(fā)和多態(tài)性分析

通過SLAF-seq 技術(shù)對(duì)親本和極端DNA池進(jìn)行測(cè)序，共獲得了126 280 064條 reads 數(shù)據(jù)，其中父本和母本分別為109 559 650，5 798 772條，抗病池和感病池分別為4 449 302，6 472 340條。測(cè)序數(shù)據(jù)的Q30均大于92%，各樣品的GC 含量差別較小，均在37.50%～37.87%，覆蓋率均在97%以上(表1)，以上結(jié)果表明，數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可用于下一步分析。根據(jù)SLAF標(biāo)簽在染色體上的分布，繪制SLAF標(biāo)簽的染色體分布圖，具體分布情況如圖4所示，開發(fā)的SLAF標(biāo)簽在基因組各染色體上分布基本均勻，共獲得188 022個(gè)SLAF標(biāo)簽。SLAF標(biāo)簽親本平均測(cè)序深度為14.55×，混池平均深度測(cè)序深度為13.01×。

表1 各樣品SLAF 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估及比對(duì)分析Tab.1 Statistics of the SLAF sequencing data of each sample

2.3 主效QTL定位與分析

在SNP-index關(guān)聯(lián)分析前，先對(duì)得到的1 485 054個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行過濾，過濾掉有多個(gè)等位基因SNP位點(diǎn)共1 358個(gè)，再過濾掉混池中reads支持度小于4的位點(diǎn)1 471 553個(gè)和親本中不存在的SNP位點(diǎn)共6 467個(gè)，其中由于9號(hào)染色體至12號(hào)染色體的SNP位點(diǎn)reads值均小于4，因此，在關(guān)聯(lián)分析時(shí)這4條染色體上的SNP位點(diǎn)被全部過濾，最終獲得了在8條染色體上的高質(zhì)量SNP位點(diǎn)5 676個(gè)，通過SNP_index算法，利用擬合后的ΔSNP_index的99百分位數(shù)，得到ΔSNP_index的關(guān)聯(lián)閾值為0.44(圖5)。在此閾值上共定位到甜瓜染色體Chr01和Chr04的2個(gè)區(qū)間，總長(zhǎng)度為2.05 Mb，包含218個(gè)基因，其中Chr01區(qū)域長(zhǎng)度為1.19 Mb，位于9 837 447～11 028 838 bp區(qū)間，包含60個(gè)基因，Chr04區(qū)域長(zhǎng)度為0.86 Mb，位于33 135 224～33 993 540 bp區(qū)間，共包含158個(gè)基因(表2)。

表2 關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistic information on the association region

2.4 候選區(qū)域基因功能分析

利用甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，應(yīng)用Blast軟件對(duì)候選區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行NR、NT、GO、KEGG、COG的深度注釋，篩選候選基因，注釋結(jié)果如表3所示，共在候選區(qū)域內(nèi)注釋到189個(gè)基因，其中在NR、NT數(shù)據(jù)庫(kù)中均注釋到189個(gè)基因，GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到96個(gè)基因，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到64個(gè)基因，COG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到67個(gè)基因。

通過對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因進(jìn)行逐條注釋分析，推測(cè)與甜瓜蔓枯病抗病性相關(guān)的候選基因，分析結(jié)果如表4所示，根據(jù)前人報(bào)道在植物中與抗病性相關(guān)的基因，預(yù)測(cè)共有15個(gè)基因與甜瓜蔓枯病抗性相關(guān)，包括1個(gè)NBS-LRR基因，5個(gè)E3泛素蛋白連接酶合成基因，1個(gè)RPM1相關(guān)蛋白基因，1個(gè)鋅指蛋白相關(guān)基因，1個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域蛋白基因，2個(gè)鈣依賴蛋白激酶基因，3個(gè)凝集素受體蛋白基因，1個(gè)RING-H2指蛋白基因。

表3 候選區(qū)域內(nèi)基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.3 Gene function annotation of candidate regions

表4 預(yù)測(cè)甜瓜蔓枯病抗性相關(guān)的基因Tab.4 Predictive genes associated with GSB resistant of melon

3 結(jié)論與討論

抗病品種的選育是防治病害最主要的途徑，對(duì)植物抗病基因的篩選能夠從分子層面明確植物的抗病機(jī)制。本研究通過 SLAF-BSA技術(shù)對(duì)甜瓜抗蔓枯病性狀進(jìn)行基因定位，開發(fā) SLAF標(biāo)簽188 022個(gè)，高質(zhì)量SNP標(biāo)記位點(diǎn)5 676個(gè)，這些信息為甜瓜抗病基因的關(guān)聯(lián)定位奠定了基礎(chǔ)，在甜瓜基因組中共獲得了2個(gè)與蔓枯病抗病相關(guān)QTL區(qū)域。分別定位在染色體Chr01和Chr04，總區(qū)間為2.05 Mb。通過篩選得到15個(gè)可能與蔓枯病抗病性相關(guān)的候選基因，其功能注釋涉及NBS-LRR蛋白，E3泛素蛋白連接酶，RPM1相關(guān)蛋白、鋅指蛋白、NAC結(jié)構(gòu)域蛋白、鈣依賴蛋白激酶等。這些基因在植物中均與抗病性密切相關(guān)。目前研究結(jié)果表明，NBS-LRR結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合ATP或GTP，參與植物抗病信號(hào)的傳遞[16]。E3泛素蛋白連接酶基因能夠調(diào)節(jié)植物的免疫反應(yīng)，在番茄葉霉病[17]、小麥白粉病[18]等病害抗病性方面均有報(bào)道，RPM1效應(yīng)蛋白[19]、鋅指蛋白[20]、NAC結(jié)構(gòu)域蛋白[21]、鈣依賴蛋白激酶[22-23]、凝集素受體激酶[24]、RING-H2 finger蛋白[25]等在也已明確許多植物能夠起到抗病調(diào)控作用。

目前，瓜類蔓枯病抗病基因的研究主要集中在甜瓜和黃瓜上，不同瓜類不同種系間的抗性遺傳特性均不一致[26]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蔓枯病抗性遺傳包括顯性遺傳和隱性遺傳，且大部分為顯性遺傳。在甜瓜不同的蔓枯病抗性材料中，已發(fā)現(xiàn)5個(gè)單獨(dú)作用的抗性基因(gsb-1、gsb-2、gsb-3、gsb-4、gsb-5)，但這些研究并明確抗病基因的定位位點(diǎn)，對(duì)甜瓜蔓枯病QTL區(qū)域內(nèi)抗病基因功能也未分析。直至2018年，Hu等[27]對(duì)甜瓜抗感材料雜交后的F2抗病性狀分離，結(jié)合基因BSA方法，首先明確了甜瓜蔓枯病的抗感遺傳為單基因顯性遺傳。并將甜瓜抗蔓枯病基因定位在了位于4號(hào)染色體的3.94～4.05 Mb的區(qū)域內(nèi)，最終確定MELO03C012987基因與蔓枯病抗病性相關(guān)，該基因?yàn)榫幋a類似于ACRE146的蛋白。但甜瓜蔓枯病抗性基因定位相關(guān)報(bào)道仍然較少。在黃瓜蔓枯病抗病基因定位研究方面，目前已發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因與黃瓜蔓枯病的抗性相關(guān)，定位在Chr01和Chr04之間，包括LRR基因、Toll蛋白結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域等[28]。本研究通過對(duì)甜瓜蔓枯病進(jìn)行QTL進(jìn)行定位，利用甜瓜全基因組信息對(duì)候選基因進(jìn)行注釋。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甜瓜上的定位與前人報(bào)道甜瓜蔓枯病和黃瓜蔓枯病的抗病基因定位區(qū)域相似，均在Chr01和Chr04的區(qū)域內(nèi)，2個(gè)作物間的蔓枯病抗病基因及抗病機(jī)制是否具有相似性值得探討。

通過前人對(duì)不同作物不同病害抗病基因的鑒定結(jié)果，本研究初步預(yù)測(cè)上述15個(gè)基因可能為參與甜瓜抗蔓枯病調(diào)控的候選基因。但具體哪些基因?qū)β莶】剐云鸬疥P(guān)鍵的主效作用仍需進(jìn)一步進(jìn)行功能及表達(dá)驗(yàn)證。在本研究基礎(chǔ)上，未來(lái)期待通過進(jìn)一步開展抗病基因克隆技術(shù)，對(duì)基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記。這些成果將對(duì)闡明甜瓜與蔓枯病菌的互作機(jī)制及蔓枯病分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。