劉 丹，梁 丹，王從磊，時(shí)曉偉，許慶芬，高 楊，候康波，張 欣，馮 剛，王建賀

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物研究所，天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

我國(guó)是世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)，也是最大的消費(fèi)國(guó)，小麥生產(chǎn)在保障國(guó)家糧食安全和提升居民生活水平中具有舉足輕重的地位[1-2]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，小麥遺傳育種研究取得了豐碩的成果，向著優(yōu)質(zhì)、抗病、高產(chǎn)、廣適的方向發(fā)展[3]。同時(shí)，每年有大量的小麥良種進(jìn)入銷售市場(chǎng)，隨之而來(lái)的種子質(zhì)量問題成為市場(chǎng)和種子企業(yè)關(guān)注的重要問題，例如發(fā)芽率、凈度及種子純度等指標(biāo)。其中，種子純度鑒定是種子生產(chǎn)企業(yè)必需具備的檢驗(yàn)技術(shù)，因此，如何快速、高效、準(zhǔn)確的鑒定種子純度，成為擺在育種家、種子銷售企業(yè)面前的重要課題。

目前，農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)方法為國(guó)標(biāo)GB/T 3543.5-1995，主要包括外觀鑒定和生理生化鑒定。隨著分子時(shí)代的到來(lái)也出現(xiàn)了DNA水平上的“分子鑒定”。外觀鑒定簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，但準(zhǔn)確性較差，且不同品種間種子外觀形態(tài)的差異越來(lái)越小，因此，靠區(qū)別種子形態(tài)上的差異來(lái)鑒定種子純度可靠性較低[4]。DNA鑒定沒有器官的特異性，不受環(huán)境的影響，有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。該技術(shù)靈敏度高、快速、多態(tài)性強(qiáng)、DNA的用量少、具有較好的重復(fù)性[5]。但是DNA鑒定需要育苗提取DNA、用特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)及電泳等過(guò)程，需要進(jìn)行數(shù)以千計(jì)的引物設(shè)計(jì)篩選[6-7]。且上述方法均只能鑒定當(dāng)代種子純度，不能鑒定下一代種子的純度，而商業(yè)化育種是要鑒定下一代種子純度，確保農(nóng)民種植不出問題，確保糧食安全。

醇溶蛋白在多種作物的籽粒中均有表達(dá)，同時(shí)其具有品種間多態(tài)性，被稱為植物的“指紋”[8-10]。在麥類作物中，醇溶蛋白的積累幾乎不受環(huán)境因素的影響，而且具有品種間異質(zhì)性，因此，可通過(guò)醇溶蛋白的多態(tài)性進(jìn)行品種的純度鑒定[11]。1986年國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)頒布了用于小麥、大麥品種鑒定的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)標(biāo)準(zhǔn)程序，用于檢測(cè)作物的純度及親緣關(guān)系。

研究表明，不同大麥品種的谷蛋白和醇溶蛋白在不同品種間存在總量、各個(gè)組分的含量的多態(tài)性，可以為群體結(jié)構(gòu)劃分和純度鑒定提供可靠數(shù)據(jù)支撐[12-14]。同時(shí)，谷子醇溶蛋白的研究也表明，不同材料間，谷子醇溶蛋白的多態(tài)性明顯，說(shuō)明醇溶蛋白也可作為谷子不同品種的“指紋”[15]。醇溶蛋白在小麥不同品種、材料中具有廣泛的等位變異，影響醇溶蛋白積累的QTL位點(diǎn)分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、6A、6B、7A、7B上[16-17]。換言之，影響和參與小麥醇溶蛋白積累的基因在染色體上均有分布，這也是小麥醇溶蛋白可作為“小麥指紋”的重要原因之一。

本研究中，通過(guò)標(biāo)記不同小麥品種開花日期，提取開花后不同天數(shù)的小麥籽粒醇溶蛋白，明確醇溶蛋白的積累模式，找到小麥籽?？梢赃M(jìn)行醇溶蛋白鑒定的最早籽粒發(fā)育時(shí)間，實(shí)現(xiàn)收獲前的純度鑒定，為鑒定種子純度提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為濟(jì)麥31、津強(qiáng)11號(hào)、津強(qiáng)13號(hào)，種植于天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物研究所實(shí)驗(yàn)田，試驗(yàn)材料由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物研究所保存。

1.2 試驗(yàn)方法

對(duì)小麥開花日期進(jìn)行標(biāo)記，收取濟(jì)麥31、津強(qiáng)11號(hào)、津強(qiáng)13號(hào)開花后5，10，15，20，25，30，35 d[18]籽粒，自然風(fēng)干，備用。

小麥育種基地，隨機(jī)選取來(lái)自不同小麥株的185個(gè)穗子，置于烘箱，60 ℃烘干，脫粒，每穗檢測(cè)1粒種子。由實(shí)驗(yàn)員隨機(jī)插入25粒不同小麥品種的籽粒(包含津強(qiáng)11號(hào))，由另外的實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行醇溶蛋白提取及檢測(cè)與雜株分析，分析后與最初實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行核對(duì)，剔除混入雜株后，計(jì)算鑒定種子純度，以確保試驗(yàn)準(zhǔn)確性。

使用研缽將收獲的籽粒研磨成粉末狀，進(jìn)行醇溶蛋白的提取。將粉末放置于2.0 mL離心管，向每個(gè)樣品即離心管中加入200 μL蛋白提取液(70%乙醇，20%蔗糖)，蓋好蓋子，置于搖床，100 r/min振蕩提取2 h。取出上步中的離心管，加入150 μL A-PAGE上樣緩沖液，80 mL丙三醇，0.02 g甲基綠，20 mL去離子水，上下顛倒混勻，常溫離心10 min (轉(zhuǎn)速12 000 r/min)。進(jìn)行A-PAGE凝膠電泳檢測(cè)[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒不同發(fā)育階段醇溶蛋白表達(dá)分析

對(duì)濟(jì)麥31、津強(qiáng)11號(hào)、津強(qiáng)13號(hào)小麥進(jìn)行開花標(biāo)記，提取小麥不同發(fā)育階段籽粒的醇溶蛋白，分別對(duì)開花后5，10，15，20，25，30，35 d和完全成熟的小麥籽粒醇溶蛋白進(jìn)行A-PAGE電泳。發(fā)現(xiàn)小麥開花后5，10 d時(shí)醇溶蛋白電泳圖譜沒有清晰明顯的條帶，此時(shí)籽粒醇溶蛋白的含量幾乎為零；濟(jì)麥31 15 d時(shí)開始出現(xiàn)條帶，津強(qiáng)11號(hào)未見明顯條帶，津強(qiáng)13號(hào)條帶明顯；開花后20 d，3個(gè)品種的條帶基本穩(wěn)定，并與完全成熟籽?；疽恢?圖1)。

2.2 津強(qiáng)11號(hào)純度鑒定

津強(qiáng)11號(hào)取株高約75 cm，籽粒紅色，田間長(zhǎng)勢(shì)基本一致(圖2)。對(duì)津強(qiáng)11號(hào)收獲前的材料進(jìn)行醇溶蛋白單粒鑒定，在第1個(gè)重復(fù)中發(fā)現(xiàn)14個(gè)與

津強(qiáng)11號(hào)帶譜不一致的電泳孔道，認(rèn)為是雜株；在第2個(gè)重復(fù)中發(fā)現(xiàn)14個(gè)與津強(qiáng)11號(hào)帶譜不一致的電泳孔道，認(rèn)為是雜株；在第3個(gè)重復(fù)中發(fā)現(xiàn)13個(gè)與津強(qiáng)11號(hào)帶譜不一致的電泳孔道，認(rèn)為是雜株(圖3)。

插入的籽粒位于第1，23，27，32，37，42，48，70，82，88，96，100，122，126，134，138，145，148，161，174，177，181，185，188，210孔道(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與電泳檢測(cè)結(jié)果位置吻合。實(shí)驗(yàn)員隨機(jī)插入25粒，檢測(cè)出25粒，吻合度為100%。

2.3 純度鑒定分析

統(tǒng)計(jì)分析表明，去掉人為插入雜株后，第1個(gè)重復(fù)共檢測(cè)63株，其中雜株7株，純度為88.89%；第2重復(fù)檢測(cè)62株，其中雜株6株，純度為90.32%；第3重復(fù)檢測(cè)61株，其中雜株4株，純度為93.44%。本試驗(yàn)田津強(qiáng)11號(hào)平均純度為90.88%(圖4)。

表1 津強(qiáng)11號(hào)醇溶蛋白品種純度鑒定插入品種及位置Tab.1 The insert variety and location in seed quality testing based on gliadin bands of Jinqiang 11

3 討論

為了簡(jiǎn)化良種繁育過(guò)程中種子純度鑒定費(fèi)時(shí)、成本高等困境，本研究通過(guò)研究醇溶蛋白表達(dá)模式，明確可鑒定醇溶蛋白的最早發(fā)育時(shí)期，從而在收獲前實(shí)現(xiàn)種子純度鑒定。

前人研究表明，編碼麥谷蛋白和醇溶蛋白的基因主要在開花后的10～20 d表達(dá)，且不同基因組的表達(dá)量及表達(dá)模式略有差異[21]。編碼α/β醇溶蛋白的基因主要在開花后10 d達(dá)到表達(dá)高峰，隨后表達(dá)量逐漸下降[22-23]。編碼γ型的醇溶蛋白的基因在不同品種間存在差異，如在中國(guó)春(Chinese Spring, CS)及中國(guó)春的1B染色體代換系(CS-1S1)呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模式。在CS-1S1中編碼γ型的醇溶蛋白的基因從開花后第5天開始表達(dá)，開花后10 d表達(dá)量迅速上升，在開花后第15天表達(dá)出現(xiàn)峰值，而中國(guó)春中編碼γ型的醇溶蛋白的基因在開花后第10天就達(dá)到了表達(dá)峰值[24-26]?？傊?，醇溶蛋白編碼基因組高豐度表達(dá)，主要集中的開花后的10～20 d。

開花后5，10，15，20，25，30，35 d到完全成熟的小麥籽粒提取醇溶蛋白發(fā)現(xiàn)，開花后10 d內(nèi)的籽粒，均未檢測(cè)到醇溶蛋白條帶，說(shuō)明醇溶蛋白在開花前期并未大量積累，與基因表達(dá)模式相吻合。濟(jì)麥31開花后第15天出現(xiàn)醇溶蛋白條帶，但條帶較弱；津強(qiáng)11號(hào)在開花后第20天出現(xiàn)可見條帶，津強(qiáng)13號(hào)在開花后第15天即可出現(xiàn)較明顯的醇溶蛋白條帶，說(shuō)明不同品種醇溶蛋白積累速度存在一定差異，但是均呈現(xiàn)出開花后20～25 d可檢出明顯、完整條帶，因此，可在小麥開花后第20～25天至收獲前均可進(jìn)行醇溶蛋白鑒定，完成純度檢測(cè)。

目前，DNA指紋純度檢測(cè)方法對(duì)于種子企業(yè)而言存在時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、成本高等諸多問題。同時(shí)，單純依靠外觀鑒定種子純度具有不確定性和風(fēng)險(xiǎn)性，通過(guò)對(duì)小麥開花后醇溶蛋白的鑒定，能夠提早準(zhǔn)確的鑒定良種田的種子純度，為良種繁育企業(yè)提供一套新的種子純度檢測(cè)技術(shù)。