孫煜，何虹，黃慧，朱健萍，盧日剛，項新華

（1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，南寧 530021； 2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

靈芝二維甲硫氨酸膠囊屬于氨基酸維生素類營養(yǎng)藥，是以甲硫氨酸、靈芝浸膏、維生素B1、維生素B2為主要原料的膠囊劑，每粒膠囊中含甲硫氨酸25 mg、靈芝浸膏12.5 mg、維生素B12 mg、維生素B21 mg。靈芝二維甲硫氨酸膠囊為口服固體制劑，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS–10001（HD–1395）–2003，該標(biāo)準(zhǔn)缺少對藥品溶出度的檢查項目［1］。固體藥物的溶出度在很大程度上影響藥物的生物等效性和生物利用度，因此需要對固體制劑的溶出度進(jìn)行嚴(yán)格控制，以保證藥物制劑的質(zhì)量和療效［2］。為提升并完善本品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制藥品質(zhì)量，確保用藥安全有效，筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)，建立了靈芝二維甲硫氨酸膠囊中三個組分溶出度的測定方法。

溶出度往往由于固體制劑的不均一性、實驗系統(tǒng)誤差大等因素出現(xiàn)偏差較大的情況，如何科學(xué)全面地評價溶出度測量結(jié)果，保證仲裁結(jié)果的可靠性和權(quán)威性，克服傳統(tǒng)誤差評定方法的局限性，是目前亟待解決的問題。測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征，其大小反應(yīng)了測量結(jié)果的可信程度以及測量方法的合理性［2–6］。因此，當(dāng)溶出度結(jié)果出現(xiàn)邊緣值而涉及符合性判斷時，測量不確定度的評定就顯得格外重要。

筆者結(jié)合靈芝二維甲硫氨酸膠囊溶出度測定方法及數(shù)據(jù)結(jié)果，首次在藥品檢測領(lǐng)域，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RB／T 141–2018 《化學(xué)檢測領(lǐng)域測量不確定度評定利用質(zhì)量控制和方法確認(rèn)數(shù)據(jù)評定不確定度》［7］，采用Top-down 不確定度評定法對其各組分測量不確定度進(jìn)行評定。該方法是一種自上而下的不確定度評定法，是在期間精密度測量條件下，將期間精密度和偏倚的累積效應(yīng)合并，視為不確定度的估計量。Top-down 評定方法簡便，操作性強(qiáng)，可以最大限度地避免影響不確定度分量的不確定性、交互效應(yīng)無法估計以及非正態(tài)繁瑣的數(shù)學(xué)運(yùn)算等問題［5–9］。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電子分析天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯儀器有限公司。

高效液相色譜（HPLC）儀：（1）Thermo Ultimate 3000 型，美國賽默飛世爾公司；（2）Waters2695–2487／996 型，美國沃特世公司。

溶出度及自動取樣系統(tǒng)：EDT–14Lx 型，印度Electrolab 公司。

甲硫氨酸對照品：批號為140684–201102，含量為100%，中國食品藥品檢定研究院。

維生素B1對照品：批號為100390–201505，含量為97.0%，中國食品藥品檢定研究院。

維生素B2對照品：批號為100369–201504，含量為98.2%，中國食品藥品檢定研究院。

靈芝二維甲硫氨酸膠囊樣品：某企業(yè)提供。

甲醇、甲酸：均為色譜純。

甲酸銨、鹽酸：均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3 或Thermo syncronis aQ 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；流動相：A 為水–1.0 mol／L甲酸銨–甲酸（990∶10∶1），B 為甲醇–1.0 mol／L甲酸銨–甲酸（990∶10∶1）；梯度洗脫（程序見表1）；流動相流量：1.0 mL／min；檢測波長：甲硫氨酸為212 nm，維生素B1與維生素B2為260 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

表1 線性梯度洗脫程序

參考文獻(xiàn)［10–22］建立溶出度檢查的高效液相色譜方法。

1.3 對照品溶液配制

甲硫氨酸對照品儲備液：1 mg／mL，取甲硫氨酸對照品適量，用0.1 mol／L 鹽酸溶液溶解并稀釋制得。

維生素B1對照品儲備液：0.05 mg／mL，取維生素B1對照品適量，用0.1 mol／L 鹽酸溶液溶解并稀釋制得。

維生素B2對照品儲備液：0.01 mg／mL，取維生素B2對照品約10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加0.1 mol／L 鹽酸溶液適量，置于65℃水浴中振搖20 min，再超聲5 min 使之溶解，用溶出介質(zhì)稀釋制得。

混合對照溶液：分別取上述3 種對照品儲備液0.75、1.0、2.5 mL 于同一25 mL 容量瓶中，用0.1 mol／L 鹽酸溶液稀釋至標(biāo)線。其中甲硫氨酸質(zhì)量濃度約為0.03 mg／mL，維生素B1質(zhì)量濃度約為2 μg／mL，維生素B2質(zhì)量濃度約為1 μg／mL。

1.4 樣品處理

取靈芝二維甲硫氨酸膠囊樣品，按《中國藥典》2015 年版四部通則0931《溶出度與釋放度測定法第二法 槳法》，以900 mL 0.1 mol／L 鹽酸溶液為溶出介質(zhì)，攪拌器轉(zhuǎn)速為75 r／min，攪拌30 min 后取溶出液10 mL，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶出介質(zhì)的選擇

分別考察了0.1 mol／L 鹽酸溶液、pH 4.5 的乙酸鹽緩沖液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液及水4 種溶出介質(zhì)，其中，pH 4.5 的乙酸鹽緩沖溶液在212 nm 波長處甲硫氨酸峰保留時間位置有明顯溶劑峰，對甲硫氨酸峰干擾明顯；維生素B2在水中溶解度較低，其對照品不易制備成水溶液，且維生素B2進(jìn)入體內(nèi)消化系統(tǒng)后主要在小腸上段被吸收，快速釋藥有利于增加其生物利用度［15］。綜合上述幾點，最終選擇接近胃酸中溶解環(huán)境的0.1 mol／L 鹽酸溶液作為溶出介質(zhì)。

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速及溶出時間的選擇

分別考察了靈芝二維甲硫氨酸膠囊樣品在0.1 mol／L 鹽酸溶液作為溶出介質(zhì)條件下，在50 r／min 及75 r／min 轉(zhuǎn)速下120 min 內(nèi)的溶出曲線，結(jié)果顯示，75 r／min 轉(zhuǎn)速條件比50 r／min 轉(zhuǎn)速條件更具有區(qū)分力，3 個組分30 min 溶出度均能達(dá)到75 %。因此最終選擇轉(zhuǎn)速為75 r／min，溶出時間為30 min。

2.3 流動相的選擇

筆者曾采用甲醇–0.07 mol／L 庚烷磺酸鈉溶液（加14 mL 三乙胺并加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.5）作為流動相［10］，梯度洗脫，但色譜圖中會因流動相梯度變化而出現(xiàn)一個峰，該峰大小與目標(biāo)成分色譜峰接近，容易造成分析干擾；并且該流動相組成為離子對試劑，對色譜柱的損耗較大。參考文獻(xiàn)［5–14］選擇對流動相組成和梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，最終流動相組成與梯度洗脫程序見1.2。

2.4 檢測波長的選擇

取對照品溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)樣，用DAD檢測器在200～400 nm 波長范圍進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，甲硫氨酸最大吸收波長約為212 nm，維生素B1最大吸收波長為247 nm，維生素B2最大吸收波長為224 nm 及269 nm。為兼顧3 組分的測定靈敏度，選擇檢測波長為212 nm 測定甲硫氨酸，檢測波長為260 nm 同時測定維生素B1、維生素B2。取對照品溶液及樣品溶液，按照1.2 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜峰的保留時間和峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算各組分溶出量。圖1、圖2 分別為對照品、樣品溶出度試驗色譜圖。

圖1 混合對照品溶液色譜圖

圖2 樣品溶液色譜圖

2.5 線性關(guān)系

分別精密稱取甲硫氨酸對照品、維生素B1對照品、維生素B2對照品適量，用0.1 mol／L 鹽酸溶液制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（見表2）。按1.2 色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。分別以甲硫氨酸、維生素B1和維生素B2的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為：Y=110.4X –0.013 59，Y=0.466 8X–0.048 79，Y=0.892 4X–0.096 52，相 關(guān) 系數(shù)分別為1.000 0，1.000 0，0.999 9。結(jié)果表明，甲硫氨 酸 在0.010 38～0.051 92 mg／mL、維 生 素B1在1.113～5.563 μg／mL、維生素B2在0.600 0～3.000 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度 μg／mL

2.6 穩(wěn)定性試驗

取中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，持續(xù)32 h，結(jié)果顯示，溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定，甲硫氨酸、維生素B1和維生素B2色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3 %、0.47 %和0.32 %（n=17）。

2.7 加標(biāo)回收試驗

按處方比例，配制混合空白樣品，稱取空白樣品約0.033 g 共9 份，分別置于9 只100 mL 容量瓶中，分別按處方含量的80%、100%、120%加入對照樣品，即加入1.0 mg／mL 甲硫氨酸對照品儲備液2.0、3.0、4.0 mL；0.2 mg／mL 維生素B1對照品儲備液0.8、1.0、1.2 mL；0.1 mg／mL 維生素B2對照品儲備液0.8、1.0、1.2 mL。用0.1 mol／L 鹽酸溶液稀釋并定容，搖勻，按照1.2 色譜條件進(jìn)樣分析，以色譜峰面積外標(biāo)法計算回收率。

結(jié)果表明甲硫氨酸、維生素B1和維生素B2的回收率良好，平均回收率分別為101.5%、99.4%、99.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8%、0.4%和0.9%（n=9)。

3 測量不確定度評定

采用Top-down 法進(jìn)行測量不確定度的評定。根據(jù)RB／T 141–2018 《化學(xué)檢測領(lǐng)域測量不確定度評定 利用質(zhì)量控制和方法確認(rèn)數(shù)據(jù)評定不確定度》［7］，將測量不確定度來源分為兩方面，即隨機(jī)效應(yīng)和系統(tǒng)效應(yīng)。隨機(jī)效應(yīng)主要通過期間精密度（uR’）來量化，系統(tǒng)效應(yīng)通過實驗室偏倚（ub）來量化。其中，按照RB／T 141–2018 要求，同時結(jié)合本實驗室標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品特點，期間精密度uR’按照標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品的變異（中間精密度數(shù)據(jù)結(jié)果）及實際樣品不同水平之間的變異（重復(fù)性數(shù)據(jù)結(jié)果）來評定；實驗室偏倚ub按照多水平加標(biāo)回收試驗結(jié)果的偏倚來評定。

3.1 數(shù)學(xué)模型及測量不確定度來源

3.1.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RB／T 141–2018，各組分溶出量的不確定度按式(1)計算：

式中：uR’，rel——期間精密度不確定度分量；

ub，rel——偏倚不確定度分量。

3.1.2 測量不確定度來源

根據(jù)式(1)確定測量不確定度的來源有期間精密度、實驗室偏倚兩項。

期間精密度引入的不確定度分量：來自于方法學(xué)驗證過程中標(biāo)準(zhǔn)溶液中間精密度試驗數(shù)據(jù)的偏差以及實際樣品多次重復(fù)測定結(jié)果的偏差引入的不確定度。按照式(2)計算：

式中：uR’，rel，s——標(biāo)準(zhǔn)溶液中間精密度不確定度分量；

ur，rel，x——樣品重復(fù)性不確定度分量。

偏倚不確定度分量：來自于方法學(xué)驗證過程中加標(biāo)回收試驗引入的不確定度。

3.2 測量不確定度評定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果

本樣品為高溶解性藥物制劑，依據(jù)《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》［23］的要求，采用單一濃度檢測各組分溶出量。

選取同水平標(biāo)準(zhǔn)溶液（即混合對照溶液）中間精密度17 個試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Anderson-Darling 檢驗（即安德森–達(dá)令檢驗，以下簡稱AD），各組分的AD 檢驗結(jié)果均小于1.0，說明數(shù)據(jù)在99%概率下接受測量系統(tǒng)的正態(tài)性與獨立性假設(shè)。數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差則視為ur’，rel，s。標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液各組分質(zhì)量濃度測定結(jié)果

3.2.2 樣品測定結(jié)果

隨機(jī)選取樣品重復(fù)試驗數(shù)據(jù)，對其中6 組數(shù)據(jù)進(jìn)行AD 檢驗，各組分測量數(shù)據(jù)均通過AD 正態(tài)及獨立性檢驗，其不確定度分量：

樣品中甲硫氨酸、維生素B1、維生素B2溶出度測定數(shù)據(jù)分別見表4、表5、表6。

表4 樣品中甲硫氨酸溶出度測定數(shù)據(jù)

表5 樣品中維生素B1 溶出度測定數(shù)據(jù)

表6 樣品中維生素B2 溶出度測定數(shù)據(jù)

3.2.3 期間精密度不確定度分量

利用標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品分析得到期間精密度，按式(2)計算不確定度分量uR’，rel，得到甲硫氨酸、維生素B1、維生素B2的期間精密度相對不確定度分量uR’，rel分別為1.23 %、0.89 %、1.00 %。

3.2.4 偏倚不確定度分量

根據(jù)加標(biāo)回收試驗3 個加標(biāo)濃度水平（120%、100%、80%）下的回收率數(shù)據(jù)進(jìn)行偏倚不確定度的評定，得到各組分偏倚不確定度分量ub，rel=brms，rel［7］。加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)及計算結(jié)果見表7～表9。

表7 甲硫氨酸加標(biāo)回收試驗結(jié)果 %

表8 維生素B1 加標(biāo)回收試驗結(jié)果 %

表9 維生素B2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果 %

3.2.5 擴(kuò)展不確定度

將期間精密度不確定度分量及偏倚不確定度分量進(jìn)行合成，得到合成不確定度，包含因子k=2，在95%概率下相對擴(kuò)展不確定度按式(1)計算，得到甲硫氨酸、維生素B1、維生素B2的溶出度結(jié)果相對擴(kuò)展不確定度分別為2.7%、1.9%、2.0%。測得樣品中甲硫氨酸、維生素B1、維生素B2的溶出度分別為92%、90%、84%，包含概率95%下的溶出度結(jié)果分別表示為(92±2.7)%、(90±1.9)%、(84±2.0)%。

4 結(jié)語

建立了靈芝二維甲硫氨酸膠囊溶出度的檢查方法，完善了現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。采用HPLC 法同時測定甲硫氨酸、維生素B1和B2的溶出量，操作簡便，數(shù)據(jù)科學(xué)、準(zhǔn)確。首次采用Top-down 不確定度評定法對化學(xué)藥品檢測進(jìn)行不確定度評定，拓展了該方法在藥品檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。