李騰飛 楊彥 黃陳

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范 圍內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤之一［1］，據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心2015年的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，CRC的發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中分別位居第3位和第5位，Ⅱ期CRC比例約占25%，其中約15%～25%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)［2］，且大約有1/5的患者在首診時(shí)就存在著遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移［3］。目前國(guó)際上統(tǒng)一使用TNM病理分期系統(tǒng)，但是出現(xiàn)了同一分期的不同患者預(yù)后有差異，ⅡB期患者的預(yù)后比ⅢA期患者差，在某些情況下導(dǎo)致Ⅱ期患者治療不足，Ⅲ期患者治療過(guò)度的情況。上述情況說(shuō)明傳統(tǒng)的臨床病理高危因素不能很好地確定CRC預(yù)后差和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者。而對(duì)于手術(shù)成功的結(jié)直腸癌患者來(lái)說(shuō)，Ⅰ期結(jié)直腸癌根治患者5年復(fù)發(fā)率為5%，Ⅱ期為12%，Ⅲ期則為33%［4］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的侵襲生長(zhǎng)受腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)的互相協(xié)同作用，基于此，腫瘤間質(zhì)比（tumor stroma ratio，TSR）的概念應(yīng)運(yùn)而生。TSR是指腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)的比值，最早由Mesker提出，并指出其在大腸癌中具有臨床意義［5］。目前TSR已在多種上皮實(shí)體類腫瘤，如CRC、乳腺癌、胃癌、食管癌等都已有報(bào)道［6-8］，然而TSR對(duì)II、Ⅲ期CRC預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值仍存在爭(zhēng)議［9-10］，鑒于此，本文旨在探討TSR對(duì)Ⅱ、Ⅲ期CRC患者預(yù)后評(píng)估中的指導(dǎo)價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

收集上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院胃腸外科2014年1月～2018年12月期間經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的臨床資料、術(shù)后病理和隨訪結(jié)果等，并進(jìn)行回顧性分析。共納入820例Ⅱ、Ⅲ期CRC患者，年齡24～95歲，平均年齡（65.6±12.0）歲，其中＜65歲372例，≥65歲448例；女性353例，男性467例；Ⅱ期497例，Ⅲ期323例；T1+T2期150例，T3+T4期670例；N0期495例，N1+N2共325例；神經(jīng)侵犯606例，無(wú)神經(jīng)侵犯214例；脈管浸潤(rùn)559例，無(wú)脈管浸潤(rùn)261例；高分化66例，中低分化754例；腫瘤直徑＜5cm510例，≥5cm310例；右半結(jié)腸癌274例，左半結(jié)腸和直腸癌共546例；黏液腺癌103例，腺癌717例。

二、納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)活檢病理組織學(xué)證實(shí)的CRC；（2）完全治愈性切除（R0切除）；（3）Ⅱ期（T3-4、N0、M0）或Ⅲ期（任何T、N1-2、M0）；（4）年齡≥18歲。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）新輔助治療（纖維化的形成影響腫瘤和基質(zhì)的數(shù)量）；（2）CRC病史或曾罹患其他惡性腫瘤，由于長(zhǎng)期治療或早期原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的可能影響了CRC的預(yù)后；（3）多發(fā)性結(jié)腸腫瘤，其預(yù)后相對(duì)更差，需要不同的治療方法；（4）術(shù)后3個(gè)月內(nèi)死亡的患者歸因于合并癥或手術(shù)并發(fā)癥。

三、切片掃描方法

將新鮮手術(shù)切除標(biāo)本用福爾馬林固定、石蠟包埋后并將腫瘤浸潤(rùn)最多的組織制成5 μm厚的HE染色玻片，利用KF-PRO系列全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)中KF-PRO-120型號(hào)數(shù)字切片掃描儀，全視野數(shù)字病理切片（whole-slide image，WSI）以KFB格式導(dǎo)出，利用K-Viewer瀏覽軟件可實(shí)現(xiàn)圖片的放大，最大可至1 600倍。共完成Ⅱ、Ⅲ期CRC患者820張HE切片的掃描。

四、TSR評(píng)估方法

WSI圖片先在K-Viewer軟件X10倍下找到腫瘤浸潤(rùn)明顯的區(qū)域，確保選取區(qū)域四周都有腫瘤組織包繞，然后在X40倍鏡下導(dǎo)出最具有侵襲性的圖片，每張WSI圖片從感興趣的區(qū)域（ROI）至少導(dǎo)出3張圖片，取平均值同時(shí)得出TSR數(shù)值。（詳見(jiàn)圖1）。當(dāng)黏液壞死組織區(qū)域出現(xiàn)在符合我們?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的視野內(nèi)時(shí)，黏液壞死組織區(qū)域被排除在外。兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家對(duì)導(dǎo)出的圖片整個(gè)腫瘤區(qū)域的TSR進(jìn)行視覺(jué)評(píng)估，在沒(méi)有一致結(jié)果的情況下，第三位病理學(xué)家介入并提供決定性意見(jiàn)。統(tǒng)計(jì)分析以50%作為截?cái)嘀?，患者根?jù)TSR被分為“高TSR組”（TSR＞50%）和“低TSR組”（TSR≤50%）［5］。

圖1 從WSI圖中導(dǎo)出3張最具有侵襲性的區(qū)域，病理學(xué)家行視覺(jué)評(píng)估TSR

五、隨訪方式

所有患者均通過(guò)門(mén)診或電話隨訪等方式進(jìn)行隨訪，隨訪至2019年7月31日或患者死亡截止。研究過(guò)程中排除了失訪病例。生存時(shí)間定義為初次手術(shù)至患者死亡或隨訪截止，統(tǒng)計(jì)患者5年總體生存率。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用COX回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，確定對(duì)預(yù)后有獨(dú)立影響的因素；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計(jì)算生存率，生存率比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、隨訪及生存情況

820例Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的隨訪資料完整，隨訪時(shí)間為1～68個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為32個(gè)月。820例Ⅱ、Ⅲ期CRC患者中，高TSR組307例，低TSR組513例，五年總生存率為81.3%（667/820），男性和女性分別為78.9%和74.8%；＜65歲和≥65歲的五年生存率為分別為90.3%和72.9%；高分化和中低分化的五年生存率分別為95%和79.7%；Ⅱ期和Ⅲ期的五年生存率分別為78.9%和73.4%；T1+T2期和T3+T4期分別是89.7%和78.4%；N0和N1+N2分期的五年生存率分別為87.4%和69.7%；腫瘤最大徑＜5 cm和≥5 cm的五年生存率分別為78.4%和80.8%；右半結(jié)腸癌和左半+直腸癌的五年生存率分別為73.9%和84%；神經(jīng)侵犯和神經(jīng)未侵犯的五年生存率分別為69.1%和84%；脈管浸潤(rùn)和脈管未浸潤(rùn)的五年生存率分別為68.5%和86.6%；黏液腺癌和腺癌的五年生存率分別為85.6%和80%。

二、腫瘤間質(zhì)比與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

本研究將入組患者的TSR高、低與其臨床資料進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TSR高的患者的臨床指標(biāo)與TSR低的患者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（見(jiàn)表1）。

表1 Ⅱ、Ⅲ期CRC患者TSR與臨床病理相關(guān)因素分析［例（%）］

三、間質(zhì)高和間質(zhì)低Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率的差異

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TSR低的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的5年總體生存率為83.2%（427/513），TSR高的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的5年總體生存率為76.2%（243/307）。Log-Rank檢驗(yàn)顯示，TSR低組的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率顯著高于TSR高組（χ2=7.991，P=0.0047）。（見(jiàn)圖2）。

圖2 TSR高和TSR低Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率比較

四、Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率影響因素分析

單因素COX回歸分析顯示，年齡、TNM分期、T分期、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管浸潤(rùn)、腫瘤分化狀態(tài)和TSR與Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的總體生存率有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；多因素COX分期顯示，年齡、腫瘤位置、脈管浸潤(rùn)和TSR是Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（見(jiàn)表2、3）。

表2 Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率影響因素的單因素COX回歸分析

表3 Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率影響因素的多因素COX回歸分析

討 論

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子等，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。腫瘤微環(huán)境在腫瘤行為中起著積極的作用，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞相互作用影響腫瘤的進(jìn)展和腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，研究認(rèn)為T(mén)SR可能反應(yīng)了這種相互作用。鑒于現(xiàn)有對(duì)TSR的研究，CRC不應(yīng)只根據(jù)腫瘤細(xì)胞特征進(jìn)行分類，還應(yīng)根據(jù)腫瘤微環(huán)境特征進(jìn)行分類，目前已經(jīng)有學(xué)者證實(shí)TSR與CRC患者的預(yù)后相關(guān)，并且可作為獨(dú)立的預(yù)后因素，高TSR組的CRC患者預(yù)后不良。TSR是CRC強(qiáng)有力的獨(dú)立預(yù)后工具，為目前臨床使用的TNM分類提供了額外的價(jià)值。

目前根據(jù)國(guó)際TNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)，同一期的不同患者預(yù)后有很大差異，有的Ⅱ期CRC的患者預(yù)后比Ⅲ期CRC患者預(yù)后差，表明現(xiàn)有的TNM分期不能很好的發(fā)現(xiàn)某些潛在的“高?！被颊撸?1］。此外針對(duì)CRC的治療，很多需要手術(shù)治療后進(jìn)行輔助放化療，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而輔助治療的方案和時(shí)間取決于TNM分期，而目前的TNM分期也不能完全精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)CRC患者對(duì)輔助放化療的敏感性。基于此，我們從腫瘤微環(huán)境出發(fā)，在病理學(xué)水平尋找更有臨床價(jià)值的高危因素。大量研究表明原發(fā)性腫瘤中TSR是一個(gè)很有潛在價(jià)值的腫瘤預(yù)后因素［12-13］，TSR高的患者預(yù)后更差。

我們回顧了上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院的2014年至2018年的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者，在腫瘤浸潤(rùn)前沿的常規(guī)蘇木精和伊紅染色石蠟切片上評(píng)估TSR。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TSR低組Ⅱ、Ⅲ期的5年總體生存率為83.2%（427/513），TSR高組Ⅱ、Ⅲ期的5年總體生存率為76.2%（243/307），Log-Rank檢驗(yàn)顯示，TSR低組總體生存率顯著高于TSR高組（χ2=7.991、P=0.0047）。我們研究證明了TSR在Ⅱ、Ⅲ期CRC的預(yù)后意義。目前由于TSR識(shí)別的簡(jiǎn)單性和可靠性，在當(dāng)前的常規(guī)病理學(xué)診斷中，TSR的實(shí)施醫(yī)療負(fù)擔(dān)較輕，且成本較低。

目前針對(duì)II、Ⅲ期CRC患者，指南建議可以輔助卡培他濱單藥或者卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑治療，這種組合已顯示出顯著改善無(wú)病生存率和總生存率的極大價(jià)值［14］。目前國(guó)內(nèi)外指南均認(rèn)為輔助化療中增加奧沙利鉑只能使高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)Ⅱ期患者受益，因此我們需要尋找Ⅱ期CRC中高危亞群患者。NCCN指南推薦［15］在高危Ⅱ期腸癌中應(yīng)用含奧沙利鉑的輔助化療方案，對(duì)于不含高危因素的中危和低危Ⅱ期腸癌患者，推薦觀察或單藥卡培他濱治療。對(duì)于Ⅲ期CRC輔助化療是主要及絕對(duì)適應(yīng)證，也是目前CRC輔助化療的主要受益人群。NCCN指南認(rèn)為所有Ⅲ期結(jié)腸癌患者都需要輔助化療。2018年的NCCN指南基于IDEA研究結(jié)果［16］指出：（1）低危Ⅲ期CRC患者輔助化療首選包括CAPOX 3個(gè)月或FOLFOX 3～6個(gè)月；（2）高危Ⅲ期CRC患者輔助化療首選包括CAPOX 3～6個(gè)月或FOLFOX 6個(gè)月，對(duì)于Ⅲ期患者如何區(qū)分高危和低危，IDEA研究指出這種根據(jù)TNM分期進(jìn)行危險(xiǎn)分層方法具有很大的局限性?；谖覀兊难芯勘砻鱐SR可以作為Ⅱ、Ⅲ期CRC患者預(yù)后獨(dú)立的因素，可以為將來(lái)的Ⅱ、Ⅲ期CRC進(jìn)行高危因素亞組分組，推薦TSR高的Ⅱ期CRC進(jìn)行卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑輔助化療方案，推薦TSR高的Ⅲ期CRC進(jìn)行6個(gè)月輔助化療，這將為Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的輔助化療提供精準(zhǔn)方案。

有學(xué)者研究表明［17］，TSR高組的Ⅱ期CRC輔助化療可明顯改善患者預(yù)后，TSR低組的Ⅲ期CRC通常不需要輔助化療。也有學(xué)者研究探索性分析表明［18］，在以?shī)W沙利鉑為基礎(chǔ)的靜脈化療中加入貝伐單抗后，TSR低組的腫瘤的DFS和OS顯著縮短，而TSR高組的腫瘤則相反，在TSR高組的腫瘤中觀察到了有益的趨勢(shì)。這些研究表明，TSR在Ⅱ、Ⅲ期CRC乃至其他惡性腫瘤中具有重要預(yù)后價(jià)值［13］。我們的多因素COX分期研究結(jié)果表明，年齡、腫瘤位置、脈管浸潤(rùn)和TSR是Ⅱ、Ⅲ期CRC患者總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），這和國(guó)外學(xué)者［11］報(bào)道具有一致性。

我們的研究對(duì)TSR在Ⅱ、Ⅲ期CRC中預(yù)后判斷得出了初步的結(jié)論，TSR高組的Ⅱ、Ⅲ期CRC的預(yù)后明顯比TSR低組的CRC患者預(yù)后差，TSR可以作為Ⅱ、Ⅲ期CRC評(píng)估患者獨(dú)立預(yù)后的指標(biāo)。TSR有望為CRC的TNM分期提供有力補(bǔ)充，并為Ⅱ、Ⅲ期CRC患者輔助放化療提供精準(zhǔn)的方案。