盧帥軍 汪 芳 張步榮 王衛(wèi)華

肝纖維化是一個復(fù)雜的病理生理過程，主要病理表現(xiàn)為肝臟中結(jié)締組織異常增生、沉積等，若不及時進行干預(yù)，易進展為肝硬化，甚至肝細胞癌[1-2]。目前，臨床亟需研發(fā)預(yù)防和治療肝纖維化的有效藥物，以抑制肝纖維化進展，降低因肝纖維化導致的死亡風險。近年來多項研究指出，肝纖維化的發(fā)病機制與第10號染色體缺失性磷酸酶及張力蛋白同源物基因(PTEN)和母親DPP同源物7(Samd7)有關(guān)[3-6]。另有研究表明，miR-216a可靶向心臟成纖維細胞中的PTEN和Samd7，促進成纖維細胞增殖和膠原纖維沉積[7]。基于上述研究，推測miR-216a可靶向PTEN和Samd7參與肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展過程。本文對此展開研究，以期為肝纖維化的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選取50只SD大鼠，均購自凱斯艾生物科技(蘇州)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SYXK(蘇)2017-0041]。所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，控制晝夜交替間隔為12 h，期間給予充足的普通飼料和水，室溫為25 ℃，濕度為60%。

1.2 試劑與儀器

透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(ⅣC)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自南京道斯夫生物科技有限公司。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒均購自北京索萊寶公司。DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-6C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司。7600型全自動生化分析儀購自日本日立公司。

1.3 肝纖維化大鼠模型制備及干預(yù)

采用腹腔注射含四氯化碳(CCl4)的橄欖油溶液方法制備肝纖維化模型大鼠[8]。隨機選取10只大鼠作為正常組，其余40只大鼠腹腔注射40%的CCl4溶液，按2 mL/kg的標準給藥，每周給藥2次，共給藥12次。給藥8次后，隨機抽取4只大鼠處死，采用HE染色和Masson染色方法判斷肝纖維化大鼠模型是否制備成功。造模期間有6只大鼠死亡，將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組、對照組和沉默組，每組10只，對照組尾靜脈注射含空載質(zhì)粒的腺病毒，沉默組尾靜脈注射含si-miR-216a質(zhì)粒的腺病毒。

1.4 指標檢測

1.4.1 HE染色和Masson染色 采用HE染色方法觀察肝臟組織的病理損傷情況，采用Masson染色方法觀察肝臟組織的膠原纖維沉積情況。于末次給藥后3 d處死各組大鼠，取其肝臟組織，使用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟和水化，最后采用HE染色和Masson染色方法觀察各組大鼠肝臟組織的病理變化。

1.4.2 HA、LN、PCⅢ和ⅣC表達水平檢測 取處死后大鼠的心臟靜脈血4 mL，3 500 r/min離心15 min，取上清液，將其保存于-20 ℃冰箱中待測。采用ELISA法檢測各組大鼠HA、LN、PCⅢ和ⅣC的表達水平。

1.4.3 miR-216a、PTENmRNA和Samd7 mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time qPCR)法檢測各組大鼠肝臟組織中miR-216a、PTENmRNA和Samd7 mRNA表達水平[9]。實驗步驟：(1)取處死后大鼠的肝臟組織，研磨后得到組織勻漿，離心后取上清液；(2)應(yīng)用TRIzol試劑(日本TaKaRa公司)提取上清液中的總RNA；(3)應(yīng)用6011A PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本TaKaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(4)使用PCR儀(美國Bio-Rad公司)擴增cDNA，擴增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，之后95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計，序列見表1。采用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.4.4 PTEN和Samd7表達水平檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠肝臟組織中PTEN和Samd7的表達水平[10]。實驗步驟：(1)取處死后大鼠的肝臟組織，用RIPA裂解液裂解肝臟細胞，提取總蛋白；(2)采用BCA法進行蛋白定量；(3)用10% SDS-PAGE分離膠進行電泳，電壓80～120 V至溴酚藍跑出膠面；(4)電流300 mA轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；(5)滴加一抗(北京百奧萊博科技有限公司)，4 ℃孵育過夜；(6)滴加二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，室溫封閉2 h；(7)ELC顯影；(8)ImageJ軟件讀取結(jié)果。內(nèi)參為GAPDH。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組肝臟組織的病理變化

如圖1所示，HE染色圖像顯示正常組的肝臟組織細胞未見壞死、炎性細胞浸潤；模型組和對照組肝臟組織細胞呈片狀壞死，炎性細胞浸潤明顯；沉默組肝臟組織細胞壞死、炎性細胞浸潤情況均較對照組有明顯改善。如圖2所示，Masson染色圖像顯示正常組肝臟組織中未見膠原纖維沉積；模型組和對照組肝臟組織中均存在嚴重的膠原纖維沉積；沉默組肝臟組織中膠原纖維沉積情況較對照組有明顯改善。上述結(jié)果提示沉默miR-216a對CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠有保護作用。

圖1 各組肝臟組織病理圖像 HE染色 ×100 A 正常組 B 模型組 C 對照組 D 沉默組

注：黃色箭頭所示為膠原纖維沉積

2.2 各組HA、LN、PCⅢ和ⅣC表達水平比較

與正常組比較，模型組HA、LN、PCⅢ和ⅣC表達水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與模型組和對照組比較，沉默組HA、LN、PCⅢ和ⅣC表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組miR-216a、PTEN mRNA和Samd7 mRNA的相對表達量比較

Real-time qPCR法檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組PTENmRNA和Samd7 mRNA相對表達量均降低，miR-216a相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與模型組和對照組比較，沉默組PTENmRNA和Samd7 mRNA相對表達量均升高，miR-216a相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

表2 各組HA、LN、PCⅢ和ⅣC的表達水平比較/ng·mL-1

表3 各組miR-216a、PTEN mRNA和Samd7 mRNA的相對表達量比較

2.4 各組PTEN和Samd7的相對表達量比較

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組PTEN和Samd7相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與模型組和對照組比較，沉默組PTEN和Samd7相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表4、圖3。

表4 各組PTEN和Samd7的相對表達量比較

圖3 各組PTEN和Samd7表達的蛋白電泳圖

3 討論

微RNA(miRNA)是一類不具備編碼蛋白質(zhì)功能的單鏈RNA，由18～24個核苷酸組成，已被多項研究證實可參與人類疾病的發(fā)生及發(fā)展過程[11-12]。近年來，越來越多的miRNA被證實與肝纖維化有關(guān)，如miR-146a[13]、miR-29b[14]和miR-214[15]等。miR-216a作為miRNA家族中的一員，已被證實與子宮內(nèi)膜癌[16]、胰腺癌[17]和乳腺癌[18]等有關(guān)，但其與肝纖維化關(guān)系的報道較少。本文主要探究沉默miR-216a對CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠的干預(yù)效果及其作用機制。

本研究采用HE染色和Masson染色判斷肝纖維化大鼠模型造模是否成功，通過觀察病理圖像可知經(jīng)CCl4誘導后，大鼠肝臟組織細胞呈片狀壞死，炎性細胞浸潤明顯，并伴有嚴重的膠原纖維沉積，表明肝纖維化大鼠模型造模成功。此外，本研究結(jié)果顯示沉默組miR-216a的表達水平低于對照組，表明沉默miR-216a表達成功。

HA、LN、PCⅢ和ⅣC的表達水平是反映肝纖維化程度的重要參考指標，常被用于評估患者的肝纖維化程度[19-20]。本研究結(jié)果表明，沉默組HA、LN、PCⅢ和ⅣC水平均低于對照組和模型組，提示沉默miR-216a可降低肝纖維化大鼠HA、LN、PCⅢ和ⅣC的表達水平。此外，病理染色圖像顯示，沉默組肝臟組織細胞壞死、炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積情況均較對照組和模型組有明顯改善。上述結(jié)果均表明沉默miR-216a對CCl4誘導的肝纖維大鼠有保護作用。

PTEN和Samd7是miR-216a的靶基因[7]，可參與肝纖維化的發(fā)病和進展。有報道指出，下調(diào)PTEN和Samd7表達可激活纖維化信號通路，從而加重相應(yīng)組織或器官的纖維化程度[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組和對照組中PTENmRNA、Samd7 mRNA、PTEN和Samd7表達均有不同程度下調(diào)，而沉默組PTENmRNA、Samd7 mRNA、PTEN和Samd7水平均升高，提示沉默miR-216a可能通過上調(diào)PTEN/Samd7信號通路，發(fā)揮其抗肝纖維化作用。

綜上所述，沉默miR-216a可降低肝纖維化大鼠HA、LN、PCⅢ和ⅣC的表達水平，改善CCl4誘導的肝纖維化損傷，其機制可能與調(diào)控PTEN/Smad7信號通路有關(guān)。