崔耀杰　金翔鳳　劉玉洪

[摘要]目的探討微小RNA-371a-5p（miR-371a-5p）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-qPCR）檢測(cè)136例NSCLC腫瘤組織和其癌旁正常組織（距離腫瘤5 cm以上）標(biāo)本miR-371a-5p的表達(dá)，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析miR-371a-5p表達(dá)與病人臨床病理特征之間關(guān)系，Kaplan-Meier生存分析模型分析miR-371a-5p表達(dá)與NSCLC病人總生存期及無(wú)病生存期的相關(guān)性。采用單因素和多因素Cox模型分析miR-371a-5p對(duì)NSCLC病人預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果與癌旁正常組織相比，NSCLC腫瘤組織miR-371a-5p表達(dá)明顯升高（t=12.515，P<0.01）。NSCLC病人miR-371a-5p高表達(dá)與腫瘤大?。é?=4.960，P<0.05）、TNM分期（χ2=7.061，P<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=10.675，P<0.01）顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-371a-5p高表達(dá)組病人的總生存期低于miR-371a-5p低表達(dá)組（χ2=9.051，P<0.001）。單因素和多因素Cox分析表明，miR-371a-5p表達(dá)可作為NSCLC病人總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)（HR=1.8，95%CI=1.0～3.2，P<0.05）。結(jié)論MiR-371a-5p在NSCLC腫瘤組織中高表達(dá)并可以作為病人的預(yù)后生物標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]癌，非小細(xì)胞肺;微RNAs;預(yù)后

[中圖分類號(hào)]R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2021）01-0069-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA-371a-5p （miR-371a-5p） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. MethodsReal-time quantitative PCR was used to measure the expression of miR-371a-5p in 136 NSCLC tissue samples and corresponding adjacent tissue samples （more than 5 cm away from the tumor）. The chi-square test was used to investigate the association between miR-371a-5p expression and clinical features， and the Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the correlation of miR-371a-5p expression with overall survival and disease-free survival of NSCLC patients. Univariate and multivariate Cox analyses were used to determine the value of miR-371a-5p in predicting the prognosis of NSCLC patients. ResultsCompared with the adjacent tissue samples， NSCLC tissue samples had a significant increase in the expression of miR-371a-5p （t=12.515，P<0.01）. The high expression of miR-371a-5p in NSCLC patients was significantly asso-ciated with tumor size （χ2=4.960，P<0.05）， TNM stage （χ2=7.061，P<0.05）， and lymph node metastasis （χ2=10.675，P<0.01）. The Kaplan-Meier survival analysis showed that the patients with high expression of miR-371a-5p had significantly lower overall survival than those with low expression of miR-371a-5p （χ2=9.051，P<0.01）. The univariate and multivariate Cox analyses showed that the expression of miR-371a-5p （HR=1.8，95%CI=1.0-3.2，P<0.05） could be used as an independent predictive factor for the overall survival of patients with NSCLC. ConclusionMiR-371a-5p is highly expressed in NSCLC tissue and can be used as a prognostic biomarker for NSCLC patients.

[KEY WORDS]carcinoma， non-small-cell lung; microRNAs; prognosis

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，每年能導(dǎo)致160萬(wàn)人以上死亡[1]。肺癌主要分為兩大類：小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）[2]。其中，NSCLC占所有肺癌類型的80%以上[3]。對(duì)于早期肺癌臨床治療主要以手術(shù)為主，中晚期肺癌臨床治療主要以化療或者化療聯(lián)合局部放射治療為主，以控制腫瘤進(jìn)展[4]。肺癌臨床診斷較晚是其預(yù)后不良的主要原因[5-7]。與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物的研究對(duì)肺癌病人的預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要意義。MicroRNA是由22～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA。目前，越來越多的研究結(jié)果表明，microRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[8-10]。MiR-371a-5p作為一種重要的miRNA，在胰腺癌、子宮絨毛膜癌以及肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11-13]。然而，miR-371a-5p在NSCLC中的作用尚不清楚。本文探討miR-371a-5p表達(dá)在NSCLC病人中的預(yù)后價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料和方法

1.1標(biāo)本及其來源

從2014—2018年在我院行胸腔鏡根治性或姑息性切除術(shù)的NSCLC病人中，選取136例NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織（距離腫瘤5 cm以上）標(biāo)本。病人術(shù)前均未接受放療或化療等輔助治療，無(wú)其他重大基礎(chǔ)疾?。ㄈ缣悄虿　⒐谛牟〉龋?，并且經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查、根據(jù)國(guó)際癌癥聯(lián)合會(huì)（UICC）第8版的術(shù)后病理分期標(biāo)準(zhǔn)確診為NSCLC。病人的腫瘤組織及正常組織使用RNA保護(hù)液固定并保存于-80 ℃冰箱中。從醫(yī)院病歷系統(tǒng)中檢索病人的臨床資料。以診斷之日起至最后一次隨訪或與癌癥相關(guān)的死亡時(shí)間計(jì)為病人的總生存期;以診斷之日至腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間計(jì)為病人的無(wú)病生存期。所有病人的最終隨訪時(shí)間均為2019年10月。

1.2實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)miR-371a-5p表達(dá)

于-80 ℃冰箱中取出預(yù)先保存的腫瘤組織標(biāo)本和正常組織標(biāo)本，應(yīng)用TRIzol試劑提取總RNA，核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定吸光度（A）值，A260/A280值為1.8～2.0表明樣本純度符合要求。使用First-Strand cDNA Synthesis試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。反應(yīng)條件為：42 ℃、2 min，37 ℃、15 min， 85 ℃、5 s。取cDNA 2 μL和SYBR Green PCR Master Mix 18 μL用于RT-qPCR。反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95 ℃、2 min;然后 95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72 ℃、5 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-371a-5p的相對(duì)表達(dá)水平。 MiR-371a-5p以及U6引物購(gòu)于上海市吉瑪基因生物科技有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。RT-qPCR引物及其序列見表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn);使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)對(duì)Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn);使用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織miR-371a-5p 表達(dá)比較

NSCLC腫瘤組織miR-371a-5p表達(dá)為1.82±0.67，正常組織為0.76±0.38，兩組比較差異有顯著性（t=12.515，P<0.01）。

2.2MiR-371a-5p表達(dá)與NSCLC病人臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)NSCLC腫瘤組織中miR-371a-5p表達(dá)的中位數(shù)，將136例病人分為高表達(dá)組（2-ΔΔCt值≥0.903 3）和低表達(dá)組（2-ΔΔCt值<0.903 3）。NSCLC組織miR-371a-5p高表達(dá)與腫瘤大小（χ2=4.960，P<0.05）、TNM分期（χ2=7.061，P<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=10.675，P<0.01）等相關(guān)。見表2。

2.3MiR-371a-5p表達(dá)與NSCLC病人預(yù)后相關(guān)性

MiR-371a-5p高表達(dá)組NSCLC病人的中位總生存期為2.33年（95%CI=0.41～4.44），中位無(wú)病生存期為1.59年（95%CI=0.32～4.32）;miR-371a-5p低表達(dá)組病人的中位總生存期為2.78年（95%CI=0.22～4.79），中位無(wú)病生存期為2.27年（95%CI=0.21～4.78）。Kaplan-Meier生存分析顯示， miR-371a-5p高表達(dá)組NSCLC病人的總生存期顯著高于低表達(dá)組（χ2=9.051，P<0.003），但是兩組之間無(wú)病生存期比較差異無(wú)顯著性（χ2=0.821，P>0.05）。見圖1。單因素Cox分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=4.5，95%CI=2.4～8.5，P<0.01）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR=2.2，95%CI=1.0～4.6，P<0.05）、TNM分期（HR=2.2，95%CI=1.2～3.8，P<0.01）和miR-371a-5p表達(dá)（HR=2.3，95%CI=1.3～3.9，P<0.01）與NSCLC病人的總生存期顯著相關(guān)。見表3。以單因素Cox分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量作為自變量進(jìn)行多因素Cox分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=4.0，95%CI=2.1～7.7，P<0.01）和miR-371a-5p表達(dá)（HR=1.8，95%CI=1.0～3.2，P<0.05）是NSCLC病人總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。見表4。

3討論

在美國(guó)，癌癥5年總體存活率在60%左右，但肺癌的5年存活率只有18%[14]。大多數(shù)的肺癌在初次診斷時(shí)即為局部晚期甚至存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也是肺癌總體預(yù)后不良的重要原因之一[15]。尋找新的治療標(biāo)靶或新的生物標(biāo)志物，對(duì)于提高肺癌病人的生存率以及改善預(yù)后具有非常重要的意義。

MiR-371a-5p作為一種重要的miRNA與多種癌癥密切相關(guān)。MiR-371a-5p在胰腺癌組織通過與TUSC7結(jié)合抑制其抑癌作用從而導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。有研究表明，miR-371a-5p可直接靶向BCCIP的3′-UTR區(qū)并參與調(diào)節(jié)子宮絨毛膜癌組織中與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的多條途徑，進(jìn)一步激活了絨毛膜癌轉(zhuǎn)移的下游通路，導(dǎo)致絨毛膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生[12]。MiR-371a-5p表達(dá)上調(diào)在乙型肝炎相關(guān)肝癌中起重要作用，其表達(dá)與HBV和睪丸激素呈正相關(guān)。HBV和睪丸激素可通過LEF-1/miR-371a-5p/SRCIN1/PTN/Slug途徑，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13]。這些研究結(jié)果表明，miR-371a-5p在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用，但miR-371a-5p在NSCLC中的作用仍不清楚。

本文RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，NSCLC腫瘤組織中miR-371a-5p的表達(dá)明顯上調(diào);miR-371a-5p表達(dá)與NSCLC的腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miR-371a-5p可以用作預(yù)后監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。本文單因素和多因素Cox分析結(jié)果顯示，miR-371a-5p表達(dá)是NSCLC病人總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。此外，Kaplan-Meier分析顯示，miR-371a-5p高表達(dá)病人總體生存率較低，提示miR-371a-5p在NSCLC中可能發(fā)揮著癌基因的作用。由于本文研究樣本數(shù)量有限，且為單中心研究，無(wú)法充分控制混雜因素的影響，因此miR-371a-5p在NSCLC發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-371a-5p在NSCLC腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)并與病人不良預(yù)后相關(guān)，miR-371a-5p可以作為一種潛在的監(jiān)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的生物標(biāo)志物。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）