余小珍　黃維清　孫鵬鵬　阮迎春　劉志晶　陳樺

[摘要]目的分析過表達(dá)OCT4后人毛囊干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本的變化及OCT4靶基因的表達(dá)。方法分別收集OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)前后的毛囊干細(xì)胞并提取總RNA，利用轉(zhuǎn)錄組測序分析全基因轉(zhuǎn)錄本的差異，并分析差異表達(dá)基因（DEGs）的功能以及OCT4靶基因的表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4后的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞亞群中分別有4 283和6 206個(gè)DEGs，轉(zhuǎn)錄本發(fā)生顯著改變。上調(diào)DEGs顯著富集于中胚層和外胚層發(fā)育的生物過程中，以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞多潛能性的信號通路中。多潛能性相關(guān)的OCT4靶基因表達(dá)顯著上調(diào)，胚胎造血基因KDR表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)。結(jié)論OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后人毛囊干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生顯著改變并獲得更多分化潛能，且懸浮細(xì)胞亞群呈現(xiàn)造血分化傾向。

[關(guān)鍵詞]OCT4;毛囊;多潛能干細(xì)胞;細(xì)胞重新編程;造血干細(xì)胞

[中圖分類號]R329.25[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0077-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the change in transcripts and the expression of the target genes of OCT4 in human hair follicle stem cells after OCT4 overexpression. MethodsTotal RNA was extracted from hair follicle stem cells before and after OCT4 transduction， and transcriptome sequencing was used to analyze the difference in transcripts. The function of differentially expressed genes （DEGs） and the expression of the target genes of OCT4 were analyzed. ResultsA total of 4 283 and 6 206 DEGs were screened out in the adherent cells and suspension cells， respectively， after OCT4 transduction， and there was a significant change in transcripts. Upregulated DEGs were mainly enriched in the biological processes of mesoderm and ectoderm development and the signaling pathways involved in regulating pluripotency of stem cells. The target genes of OCT4 associated with pluripotency were significantly upregulated， and the expression of the embryonic hematopoietic gene KDR continued to increase. ConclusionAfter OCT4 transduction， human hair follicle stem cells show a significant change in transcriptome and obtain a higher level of pluripotency， and the suspension cells show a tendency of hematopoietic differentiation.

[KEY WORDS]OCT4; hair follicle; pluripotent stem cells; cellular reprogramming; hematopoietic stem cells

利用基因工程技術(shù)能夠?qū)⒁环N細(xì)胞重編程并直接轉(zhuǎn)分化成另一種細(xì)胞[1-2]。我們的前期研究將這一技術(shù)應(yīng)用于人毛囊干細(xì)胞（hHFMSC），并成功地將其轉(zhuǎn)分化為紅細(xì)胞。過表達(dá)OCT4的hHFMSC在培養(yǎng)過程中從貼壁細(xì)胞中逐漸產(chǎn)生一類小而圓、易懸浮的新的細(xì)胞亞群，該細(xì)胞亞群經(jīng)造血誘導(dǎo)培養(yǎng)和紅系生長因子刺激后能夠向成熟的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[3]。hHFMSC本身具有多向分化的潛能[4]，在轉(zhuǎn)導(dǎo)4個(gè)多潛能轉(zhuǎn)錄因子（OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc）后可以被重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），而單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4可以被誘導(dǎo)生成紅細(xì)胞，但OCT4重編程hHFMSC的機(jī)制尚未有研究。本研究在前期研究的細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)錄組測序分析OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后全基因轉(zhuǎn)錄組的改變，通過功能富集分析以及KEGG分析探索OCT4對各譜系細(xì)胞發(fā)育的核心調(diào)控作用，篩查OCT4下游靶基因，旨在探討OCT4重編程hHFMSC的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞樣本及培養(yǎng)方法

前期工作中分離并鑒定后獲得的hHFMSC;hHFMSCOCT4-adherent：應(yīng)用含有OCT4 cDNA的慢病毒載體pLV-EF1α-OCT4-IRES-EGFP以及含有表達(dá)pVSVG、gag-pol和rev包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)導(dǎo)hHFMSC，并經(jīng)OCT4基因表達(dá)鑒定的貼壁細(xì)胞;hHFMSCOCT4-floating：收集hHFMSCOCT4-adherent的上層培養(yǎng)液，離心重懸后獲得的懸浮細(xì)胞。

培養(yǎng)條件：hHFMSC接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，hHFMSCOCT4-adherent、hHFMSCOCT4-floating細(xì)胞接種于Matrigel包被的培養(yǎng)板上。3種細(xì)胞均用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、10 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的H-DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2RNA提取及測序

每組細(xì)胞準(zhǔn)備3個(gè)重復(fù)的獨(dú)立樣本，送至上海歐易公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。按照說明書的操作步驟，使用mirVana miRNA Isolation Kit提取各樣本總RNA，應(yīng)用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢，將RNA完整性編號（RIN）≥7的樣本被納入后續(xù)分析。富集的mRNA加入打斷試劑使其片段化，合成的雙鏈cDNA經(jīng)純化、修復(fù)和連接測序接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit構(gòu)建文庫，通過Illumina HiSeq X Ten sequencer進(jìn)行測序。

1.3差異表達(dá)基因（DEGs）分析及富集計(jì)算

使用Trimmomatic軟件對Raw reads進(jìn)行質(zhì)控，將經(jīng)去接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和堿基過濾處理得到的Clean reads與參考基因組進(jìn)行比對，使用cufflinks和DESeq軟件分別對基因表達(dá)進(jìn)行定量和標(biāo)準(zhǔn)化，按照差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）>2或<-2以及P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出DEGs。利用DAVID數(shù)據(jù)庫中的Function Annotation 工具對DEGs分別進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號通路富集分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用R package計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)及進(jìn)行負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)。相關(guān)系數(shù)越接近1，表示樣本間的相似度越高;負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)用于擬合基因覆蓋的Reads數(shù)、校正由基因長度引起的誤差和對基因表達(dá)量的差異進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因轉(zhuǎn)錄本的差異分析

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，與hHFMSC相比較，hHFMSCOCT4-adherent中共有4 283個(gè)DEGs，其中上調(diào)者2 401個(gè)，下調(diào)者1 882個(gè);hHFMSCOCT4-floating中有6 106個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因3 107個(gè)，下調(diào)基因2 999個(gè);與 hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中篩選出1 940個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因833個(gè)，下調(diào)基因1 107個(gè)。見圖1。表明各組細(xì)胞樣本中基因組轉(zhuǎn)錄本具有顯著差異，且懸浮細(xì)胞與hHFMSC相比DEGs數(shù)目最多;另外，同為OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄本明顯不同，說明二者可能具有不同的分化潛能。

2.2DEGs的聚類分析

根據(jù)每組樣本DEGs的表達(dá)量繪制熱圖（圖2）進(jìn)行水平聚類分析，結(jié)果顯示，各組內(nèi)樣本水平聚類距離更近，而組間樣本聚類距離相對較遠(yuǎn)，表明各組內(nèi)樣本具有良好的重復(fù)性，組間樣本的基因表達(dá)量具有顯著差異。

2.3DEGs的功能富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對生物過程、細(xì)胞組分和分子功能進(jìn)行富集分析的結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞分別與hHFMSC相比，上調(diào)基因顯著富集于中胚層（胸腺、肢體、血管、肌肉、骨骼、心臟）及外胚層（內(nèi)耳、腦、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、乳房）的器官發(fā)育及細(xì)胞分化生物過程中（圖3）。表明hHFMSC在轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4后獲得了更多方向的分化潛能，甚至可能具有跨胚層發(fā)育的潛能。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對KEGG信號通路進(jìn)行富集分析的結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞分別與hHFMSC相比，調(diào)節(jié)干細(xì)胞多潛能性的信號通路中分別有29個(gè)和31個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，包括ID3、BMP4、KLF4、LEFTY2和MYC等。進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4可能通過該通路調(diào)節(jié)hHFMSC的多潛能性。見表1。

2.4OCT4靶基因的表達(dá)

在轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4之后，hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating中OCT4（POU5F1）表達(dá)上調(diào)倍數(shù)分別為4 859.8和6 958.3倍，兩組分別有81和96個(gè)OCT4的下游靶基因表達(dá)發(fā)生改變，其中上調(diào)基因分別為48和38個(gè)，下調(diào)基因分別為33和58個(gè);而hHFMSCOCT4-floating與hHFMSCOCT4-adherent相比，有26個(gè)OCT4靶基因表達(dá)發(fā)生改變，其中上調(diào)基因4個(gè)，下調(diào)基因22個(gè)。功能分析表明，與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-adherent 中有SOX5、LEFTY2等11個(gè)多潛能性相關(guān)靶基因表達(dá)上調(diào)，而hHFMSCOCT4-floating中有LEFTY2、STAT3等9個(gè)多潛能性相關(guān)靶基因表達(dá)上調(diào);相比hHFMSCOCT4-adherent，hHFMSCOCT4-floating中HESX1、LEFTY2等5個(gè)多潛能性相關(guān)靶基因表達(dá)下調(diào)。研究結(jié)果表明，OCT4轉(zhuǎn)入 hHFMSC后，對基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了重編程，通過上調(diào)其他多潛能性基因使細(xì)胞獲得更多分化潛能。另外，促紅細(xì)胞生成基因CA2和胚胎造血相關(guān)基因KDR在貼壁細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，說明CA2、KDR基因在OCT4促進(jìn)造血譜系分化的過程中可能發(fā)揮重要的作用。直接與hHFMSCOCT4-adherent進(jìn)行比較，hHFMSCOCT4-floating中部分多潛能相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，KDR基因表達(dá)繼續(xù)上調(diào)，另一個(gè)造血相關(guān)靶基因HIST1H3D表達(dá)也上調(diào)，結(jié)果表明hHFMSCOCT4-floating可能丟失一定的多潛能性，并同時(shí)獲得造血譜系分化傾向（圖4）。

3討論

OCT4是維持干細(xì)胞自我更新的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以與靶基因啟動子區(qū)結(jié)合激活其表達(dá)[5-6]，包括維持胚胎干細(xì)胞自我更新有關(guān)基因的表達(dá)[7]。在調(diào)節(jié)細(xì)胞多潛能性的基因網(wǎng)絡(luò)中，OCT4發(fā)揮核心調(diào)控作用[8-10]。OCT4可結(jié)合自身基因及其他多潛能性基因NANOG、SOX2、SALL4等的啟動子并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)[5-6];另一方面，OCT4與抑制性基因的啟動子相結(jié)合可抑制其轉(zhuǎn)錄激活，而這些抑制性基因的主要功能是促進(jìn)譜系特異性分化[11-12]。已有研究證實(shí)，OCT4表達(dá)下調(diào)時(shí)，與內(nèi)胚層譜系發(fā)育和細(xì)胞分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[13]，因此OCT4對于胚胎干細(xì)胞多潛能性的維持和成體細(xì)胞重編程均具有關(guān)鍵作用[14-15]。此外，最近有研究結(jié)果證實(shí)，單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4即可賦予成纖維細(xì)胞向三胚層譜系轉(zhuǎn)分化的“可塑性”（不是完全去分化的多潛能性），即轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4可以上調(diào)造血、神經(jīng)發(fā)育及內(nèi)胚層發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，在進(jìn)一步的譜系特異性信號刺激下分別向中胚層（造血祖細(xì)胞）和外胚層（神經(jīng)祖細(xì)胞）分化[16-17]。并且，與其他多潛能基因（NANOG或SOX2）相比，只有過表達(dá)OCT4才能產(chǎn)生全新的中間狀態(tài)細(xì)胞（非iPSC），并形成造血樣克?。ū磉_(dá)CD45）[18]，表明OCT4對于體細(xì)胞向造血譜系分化具有重要作用。

繼轉(zhuǎn)導(dǎo)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子重編程體細(xì)胞使其獲得多潛能性后[19-20]，近些年研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4就可重編程體細(xì)胞[21]。之前研究中，需要通過慢病毒向體細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)多個(gè)重編程基因，其誘導(dǎo)過程復(fù)雜，而且導(dǎo)入多因子可能影響基因組穩(wěn)定性，因此應(yīng)用具有一定局限性。hHFMSC來源于毛囊，具有來源豐富、獲取簡單、無免疫原性等應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)[12]，因此可以作為基因工程細(xì)胞進(jìn)行重編程、轉(zhuǎn)分化等研究。本研究通過RNA測序在轉(zhuǎn)錄水平檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4后轉(zhuǎn)錄組的變化，探討OCT4對hHFMSC分化潛能的影響及其分子機(jī)制。

本研究中，單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)OCT4入hHFMSC后產(chǎn)生貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞兩個(gè)亞群，與hHFMSC相比，這兩種細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄本均發(fā)生顯著變化，篩選出DEGs并進(jìn)一步進(jìn)行功能分析顯示，上調(diào)DEGs顯著富集于外胚層和中胚層各器官發(fā)育及細(xì)胞分化的生物過程中，并且顯著富集于調(diào)節(jié)干細(xì)胞多潛能性的信號通路中，說明OCT4重編程的細(xì)胞亞群獲得了跨譜系、跨胚層分化的多潛能性。直接比較貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞則顯示，這兩種細(xì)胞為相對獨(dú)立的亞群，具有差異顯著的轉(zhuǎn)錄組，盡管其差異性不及OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)前后的變化。本研究結(jié)果還顯示，懸浮細(xì)胞亞群中OCT4的上調(diào)倍數(shù)明顯高于貼壁細(xì)胞，推測OCT4的較高表達(dá)量可能與懸浮細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān);另一方面，貼壁細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)后黏附性降低、細(xì)胞變圓，而懸浮細(xì)胞也可以重新貼壁培養(yǎng)并形成集落[3]，說明兩種亞型之間能相互轉(zhuǎn)化衍生，其具體機(jī)制尚待研究。對OCT4下游靶基因進(jìn)行分析表明，hHFMSC中OCT4可能通過上調(diào)多潛能性相關(guān)靶基因LEFTY2、SOX5、FGFR2及STAT3等的表達(dá)，使hHFMSC重編程并獲得更多的分化潛能，而懸浮細(xì)胞中一部分多潛能性靶基因表達(dá)量下降，表明該細(xì)胞亞群的自我更新與分化的平衡有所傾斜，可能更易于發(fā)生轉(zhuǎn)分化。在OCT4的靶基因中，胚胎造血相關(guān)基因KDR與紅系生成相關(guān)基因CA2及造血基因HIST1H3D均表達(dá)上調(diào)，說明懸浮細(xì)胞具有一定的紅系分化傾向。因此，在給予造血相關(guān)細(xì)胞因子刺激后，懸浮細(xì)胞最終能夠轉(zhuǎn)分化為成熟的紅細(xì)胞[3]。然而，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞多潛能性及其他生物學(xué)功能的差異仍需進(jìn)一步探討，OCT4轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞具有哪些組織特異性細(xì)胞分化能力也需進(jìn)行相關(guān)研究證實(shí)。

本研究通過RNA測序方法探討過表達(dá)OCT4后hHFMSC基因轉(zhuǎn)錄組的變化及其對分化潛能的影響，尋找OCT4通過調(diào)控靶基因表達(dá)使體細(xì)胞去分化的分子依據(jù)，為hHFMSC在基因工程研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為臨床應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行個(gè)體化治療提供了新的細(xì)胞來源。

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（本文編輯 馬偉平）