孫雪純　楊紹楠　王源　張雅夢　潘旭東　馬愛軍

[摘要]目的探討早老素-1（PSEN-1）p.Met139Ile突變對早發(fā)性阿爾茨海默病（EOAD）人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y細胞）模型中相關(guān)蛋白及microRNA-34a（miR-34a）表達的影響。方法分別將攜帶有陰性對照空載體的慢病毒（NC組）、野生型PSEN-1的慢病毒（WT組）以及突變型PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）的慢病毒（MT組）轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞，以未感染慢病毒細胞作為正常組（N組）。ELISA方法檢測各組細胞β-淀粉樣蛋白表達（Aβ42/Aβ40值），Western blot方法檢測各組PSEN-1、淀粉樣蛋白前體（APP）、NOTCH-1蛋白的表達，qRT-PCR方法檢測各組miR-34a的表達。結(jié)果與N組、NC組、WT組比較，MT組Aβ42/Aβ40值、PSEN-1蛋白、APP蛋白及miR-34a表達升高，而NOTCH-1蛋白表達下調(diào)，差異有顯著性（F=28.540～425.600，q=7.349～30.180，P<0.05），N組、NC組、WT組各指標比較差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論PSEN-1 p.Met139Ile為致病性突變位點，可引起SH-SY5Y細胞模型中相關(guān)蛋白及miR-34a的異常表達。

[關(guān)鍵詞]早老素-1;阿爾茨海默病;淀粉樣β肽類;微RNAs

[中圖分類號]R745.7[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0087-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the influence of presenilin-1 （PSEN-1） p.Met139Ile mutation on the expression of related proteins and microRNA-34a （miR-34a） in a model of human neuroblastoma SH-SY5Y cells in early-onset Alzheimers di-sease. MethodsSH-SY5Y cells were transfected with the lentivirus carrying negative control （NC group）， the lentivirus carrying wild-type PSEN-1 （WT group）， and the lentivirus carrying mutant-type PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C） （MT group）， and the cells not transfected with lentivirus were established as normal group （N group）. ELISA was used to measure the expression of amyloid β-proteins （Aβ42/Aβ40 ratio）; Western blot was used to measure the protein expression of PSEN-1， amyloid precursor protein （APP）， and NOTCH-1; qRT-PCR was used to measure the expression of miR-34a. ResultsCompared with the N， NC， and WT groups， the MT group had significant increases in Aβ42/Aβ40 ratio and expression of PSEN-1， APP， and miR-34a and a significant reduction in the expression of NOTCH-1 （F=28.540-425.600，q=7.349-30.180，P<0.05）， while there were no significant differences in these indices between the N， NC， and WT groups （P>0.05）. ConclusionPSEN-1 p.Met139Ile is a pathogenic mutation site and can cause abnormal expression of related proteins and miR-34a in the model of SH-SY5Y cells.

[KEY WORDS]presenilin-1; Alzheimer disease; amyloid beta-peptides; microRNAs

早發(fā)性阿爾茨海默?。‥OAD）常由早老素-1（PSEN-1）、PSEN-2和淀粉樣蛋白前體（APP）等基因的突變導致[1]，其中PSEN-1突變占70%～80%[2]。PSEN-1作為γ-分泌酶的重要組成部分，其突變會影響APP、NOTCH-1以及β-淀粉樣蛋白（Aβ）的表達[1，3]。微小RNA（miRNA）是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過識別靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)（3′UTR），并與之結(jié)合以抑制靶基因的表達[4]。最近研究結(jié)果表明，多種miRNA參與調(diào)控阿爾茨海默病（AD）的病理過程，miR-101、miR-106靶向APP可促進Aβ產(chǎn)生[5]。 既往我們在一家族性EOAD家系中發(fā)現(xiàn)存在PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）突變，本研究在體外建立PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C） 突變?nèi)松窠?jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y細胞）模型，分別檢測其Aβ42/Aβ40、PSEN-1、APP、NOTCH-1及microRNA-34a（miR-34a）的表達，以探討PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）突變對SH-SY5Y細胞模型的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞購自上海中喬新舟公司，培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.44的MEM、體積分數(shù)0.44的F12、體積分數(shù)0.10的胎牛血清、體積分數(shù)0.01的雙抗及體積分數(shù)0.01的丙酮酸鈉培養(yǎng)液中，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實驗所用細胞的傳代次數(shù)均控制在P10～P30之間。

1.2實驗分組及處理

將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞接種于96孔板，細胞生長匯合度在20%～30%時，隨機分為N組（正常細胞組，未感染慢病毒）、NC組（陰性對照組，感染攜帶有陰性空載體的慢病毒）、WT組（野生型PSEN-1組，感染攜帶有野生型PSEN-1的慢病毒）、MT組（突變型PSEN-1組，感染攜帶有突變型PSEN-1 p.Met139Ile（c.417G>C）的慢病毒）。各組分別將相應(yīng)的慢病毒感染至SH-SY5Y細胞中，同時更換培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。慢病毒感染約96 h后，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)于含3 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液中，每3～4 d更換1次含嘌呤霉素的培養(yǎng)液，直至未感染病毒的N組細胞被殺光，將嘌呤霉素濃度減至維持濃度（1 mg/L），繼續(xù)對感染后的細胞進行篩選和擴增。同時，收集細胞分別進行DNA測序鑒定，并將鑒定結(jié)果正常的細胞凍存保種。慢病毒購自上海吉凱基因科技有限公司。

1.3DNA提取和測序

使用細胞基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取各組細胞基因組的DNA。使用分光光度計測DNA濃度。DNA擴增引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成。上游引物：5′-ATACCGAGAC-TGTGGGCCAG-3′，下游引物：5′-ATGAGCCACG-CAGTCCATTC-3′。按照2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）說明書進行PCR擴增。擴增后的產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，將DNA擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行基因測序。

1.4檢測指標及方法

1.4.1Aβ42/Aβ40表達應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，按照ELISA試劑盒（Elabscience）說明書進行操作。用酶標儀檢測450 nm波長處光密度（OD）值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數(shù)坐標紙上繪制四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線，計算各組Aβ40和Aβ42的表達。

1.4.2PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白表達采用Western blot方法檢測。應(yīng)用RIPA緩沖液+蛋白酶抑制劑（體積比為100∶1）對各組細胞進行裂解。應(yīng)用BCA試劑盒測定收集到的蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣本與上樣緩沖液混合后煮沸變性，然后在不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠（分別為100 g/L的聚丙烯酰胺分離凝膠和50 g/L的聚丙烯酰胺濃縮凝膠）中進行電泳，將凝膠中的蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用50 g/L的脫脂牛奶在室溫下進行封閉，將負載蛋白的PVDF膜分別用原代羊抗兔抗體PSEN-1（1∶1 000）、APP（1∶1 000）、NOTCH-1 （1∶1 000）孵育，用HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000） 室溫孵育1～2 h。用蛋白凝膠成像儀檢測PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白，應(yīng)用Image J軟件計算各蛋白的表達結(jié)果。

1.4.3miR-34a表達應(yīng)用TRIzol方法提取各組細胞總RNA，采用分光光度計測定RNA濃度。應(yīng)用microRNA專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBRR qRT-PCR User Manual，TAKARA公司）反轉(zhuǎn)錄得到microRNA的cDNA產(chǎn)物。按照TB Green Premix Ex TaqⅡ說明書，應(yīng)用兩步法進行qRT-PCR擴增。以U6基因作為內(nèi)參對照。以2-ΔΔCt法計算各組miR-34a的表達。

以上所有指標檢測均重復3次。

1.5統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS Version 21.0軟件進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的計量資料結(jié)果以±s表示，兩組比較采用t檢驗;多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染后SH-SY5Y細胞基因測序

熒光顯微鏡下觀察顯示，慢病毒對SH-SY5Y細胞的感染效率在80%以上（圖1A）。序列分析顯示，WT組細胞在PSEN-1的417位點發(fā)生G→C突變，即第5號外顯子的139號密碼子發(fā)生ATG→ATC錯義突變（圖1B、C）。

2.2各組Aβ42/Aβ40值比較

MT組Aβ42/Aβ40值明顯高于N組、NC組、WT組，差異有顯著意義（F=119.700，q=14.680～16.150，P<0.05）。N組、NC組、WT組Aβ42/Aβ40值比較差異均無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.3各組PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白表達比較

與N組、NC組和WT組比較，MT組PSEN-1和APP蛋白表達升高，NOTCH-1蛋白表達水平顯著降低，差異有顯著性（F=90.680～425.600，q=12.120～30.180，P<0.05）。N組、NC組和WT組PSEN-1、APP、NOTCH-1蛋白表達比較差異無顯著性（P>0.05）。見圖2、表1。

2.4各組miR-34a表達比較

MT組miR-34a表達明顯高于N組、NC組和WT組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（F=28.540，q=7.349～7.762，P<0.05）。N組、NC組和WT組miR-34a比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

目前已有超過200種PSEN-1突變對EOAD來說是致病性的[6]，在致病性PSEN-1突變中，大多數(shù)為錯義突變導致氨基酸的替換。本團隊首次發(fā)現(xiàn)在PSEN-1的417位點發(fā)生G→C突變，致使第5號外顯子的139號密碼子發(fā)生ATG→ATC錯義突變，從而導致該密碼子編碼的氨基酸由蛋氨酸（Met）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）。本文進一步研究該突變位點的致病功能：首先通過慢病毒感染該突變位點至SH-SY5Y細胞，基因測序驗證SH-SY5Y細胞模型構(gòu)建成功;ELISA方法檢測顯示AD的特征性指標Aβ42/Aβ40值升高，Western blot方法檢測顯示APP、PSEN-1蛋白表達升高，這與AD病理變化相符合，進一步驗證了體外SH-SY5Y細胞模型構(gòu)建成功，也證實了PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）這一突變位點為致病性突變。

AD的重要病理特征是腦內(nèi)Aβ沉積形成的老年斑，具體表現(xiàn)為Aβ42/Aβ40的比值增加。Aβ是由APP經(jīng)γ-分泌酶剪切所產(chǎn)生，γ-分泌酶的主要催化亞基為PSEN-1，研究認為，突變型PSEN-1在切割A(yù)PP時易形成更多的Aβ42，從而使Aβ42/Aβ40值升高。還有研究發(fā)現(xiàn)，γ-分泌酶也參與剪切神經(jīng)信號傳導通路上的重要蛋白，如NOTCH等[7-8]。Notch信號通路中，γ-分泌酶將NOTCH切割后，胞內(nèi)片段（NICD）轉(zhuǎn)移到核內(nèi)激活基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的生成、分化以及存活。研究結(jié)果顯示，AD的病因之一可能是γ-分泌酶切割A(yù)PP釋放的APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（AICD）產(chǎn)物抑制了Notch通路[7]。作為γ-分泌酶的重要組成部分，PSEN-1突變可阻斷NOTCH-1剪切及核轉(zhuǎn)位，NOTCH-1蛋白減少可能使淀粉樣蛋白積聚導致神經(jīng)細胞易于凋亡，其機制可能與相應(yīng)微環(huán)境支持及神經(jīng)細胞自身端粒酶活性限制有關(guān)。也有研究認為NOTCH-1蛋白下調(diào)可能影響海馬突觸的可塑性，進而導致記憶障礙[8]。本文研究顯示，在PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突變的SH-SY5Y細胞模型中Aβ42/Aβ40比值、PSEN-1蛋白、APP蛋白的表達升高，NOTCH-1蛋白表達下降，推測PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突變位點為致病性突變位點，可以造成AD的病理改變，致使Aβ42/Aβ40值增高。已有研究顯示，多種miRNAs，如miR-124、miR-107、miR-29等參與AD的病理過程[9]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，AD病人血漿中miR-34a升高，認為其可以作為AD的生物標志物[10]。本文結(jié)果顯示miR-34a表達上調(diào)，與相關(guān)研究結(jié)果相符[9-10]。miR-34a表達升高具體機制尚不十分明確，可能是抑制神經(jīng)元突觸可塑性、氧化磷酸化和糖酵解等相關(guān)基因所致[11-12]。研究顯示，miR-34a通過調(diào)節(jié)AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型Bcl-2的表達而引起AD細胞凋亡[13];miR-34a通過調(diào)控NOTCH-1增加腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤進展[14-15]。然而，miR-34a及NOTCH-1蛋白在EOAD中作用的研究未見報道。后續(xù)我們將進一步研究miR-34a與NOTCH-1蛋白在EOAD細胞模型中的作用及其機制，為EOAD的治療提供依據(jù)。

綜上，轉(zhuǎn)染PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突變位點可在體外成功構(gòu)建SH-SY5Y細胞模型，對該細胞模型研究顯示Aβ42/Aβ40值、PSEN-1蛋白、APP蛋白、miR-34a表達升高，NOTCH-1蛋白表達下降。認為PSEN-1 p.Met139Ile （c.417G>C）突變位點為EOAD致病性突變位點，miR-34a可能通過與NOTCH-1蛋白作用參與調(diào)控EOAD的病理機制。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）