胡曉燕　周燕　崔珺　魏玉嬌　馬瑞霞

[摘要]目的觀察狼瘡性腎炎（LN）病人腎組織巨噬細(xì)胞的局部浸潤情況，探討其與病人血清、尿液腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的關(guān)系。方法選取60例經(jīng)腎組織活檢診斷為LN病人和10例腎組織正常病人（對照組）為研究對象。采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察腎組織中巨噬細(xì)胞的浸潤情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法測定血清、尿液TNF-α水平，并對兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果60例LN病人中，活動組34例（SLEDAI≥9分定義為疾病活動），非活動組26例。LN病人腎組織巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出異常激活，即浸潤程度較對照組明顯增高，且活動組明顯高于非活動組（F=56.085，P<0.01）。LN病人血清、尿液中TNF-α水平較對照組明顯升高，且活動組明顯高于非活動組（F=50.234、52.982，P<0.01）。Pearson直線相關(guān)分析顯示，LN病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平有明顯相關(guān)性（r=0.728、0.716，P<0.01）。結(jié)論LN病人腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多，巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平呈正相關(guān)，且與腎臟損傷和疾病活動性存在明顯相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]狼瘡腎炎;巨噬細(xì)胞;腫瘤壞死因子α

[中圖分類號]R593.242[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0091-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate local macrophage infiltration in the renal tissue of patients with lupus nephritis （LN） and its correlation with the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in serum and urine. MethodsA total of 60 patients with LN diagnosed by renal biopsies and 10 subjects with normal renal tissue were enrolled. Immunohistochemistry was used to observe macrophage infiltration in renal tissue， double-antibody sandwich ELISA was used to measure the level of TNF-α in serum and urine， and a correlation analysis was performed. ResultsAmong the 60 patients with LN， 34 had an active disease （a Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index of ≥9 was defined as active systemic lupus erythematosus） and 26 had a non-active disease. The patients with LN had abnormal activation of macrophages in renal tissue， with a significantly higher degree of macrophage infiltration than the normal control group， and the active group had a significantly higher degree of macrophage infiltration than the non-active group （F=56.085，P<0.01）. Compared with the normal control group， the patients with LN had significant increases in the level of TNF-α in serum and urine， and the active group had significantly higher levels than the non-active group （F=50.234，52.982;P<0.01）. The Pearson linear correlation analysis showed that renal macrophage infiltration was significantly correlated with the level of TNF-α in serum and urine in patients with LN （r=0.728，0.716;P<0.01）. ConclusionPatients with LN have a significant increase in macrophage infiltration， which is positively correlated with the level of TNF-α in serum and urine and is significantly correlated with renal injury and disease activity.

[KEY WORDS]lupus nephritis; macrophage; tumor necrosis factor-alpha

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）多見于青年女性，是一種自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要特征是產(chǎn)生大量自身抗體以及多系統(tǒng)受累。腎臟為其最常見和嚴(yán)重的損害器官，腎活檢顯示SLE幾乎全部存在腎臟受累[1]，其中50%～80%有腎炎表現(xiàn)，即為狼瘡性腎炎（LN）。LN嚴(yán)重影響病人預(yù)后，因此及時有效地診斷及治療至關(guān)重要。免疫調(diào)節(jié)失衡與炎癥反應(yīng)是LN的主要特征，同時也是LN的重要發(fā)病機(jī)制[2]。而巨噬細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是炎癥反應(yīng)中最主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞和免疫反應(yīng)中最重要的吞噬細(xì)胞，已證實(shí)活化的巨噬細(xì)胞在LN 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵性作用。巨噬細(xì)胞可以直接損傷腎臟固有細(xì)胞，還可以分泌多種細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤和廣泛的細(xì)胞增生。有研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞廣泛參與LN小鼠的增生性病變，若特異性地清除巨噬細(xì)胞則可明顯抑制LN的增生性病變[3]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞等分泌，在免疫細(xì)胞間起著相互聯(lián)系的介導(dǎo)作用[4]，決定免疫應(yīng)答的性質(zhì)，因此研究TNF-α在LN中的表達(dá)具有重要的臨床價值。目前，國內(nèi)有關(guān)LN病人腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平關(guān)系的研究報道甚少。故本研究對二者的關(guān)系進(jìn)行了分析，旨在進(jìn)一步探討LN的發(fā)病機(jī)制，為LN病人提供活動性預(yù)測及藥物治療反應(yīng)性評估的無創(chuàng)性指標(biāo)。

1對象和方法

1.1研究對象

2017年12月—2019年6月，青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科及風(fēng)濕免疫科收治的有完整病情記錄的LN病人60例（年齡≥18歲）。60例LN病人均符合美國風(fēng)濕協(xié)會SLE的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)腎穿刺活檢術(shù)證實(shí)為LN[5]。所有病人均無類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染性疾病等，非妊娠及哺乳期婦女，均無腎臟原發(fā)性損害及糖尿病、高血壓等繼發(fā)的腎臟損害，近3個月內(nèi)無服用免疫抑制劑史或3個月內(nèi)使用潑尼松的劑量<30 mg/d。60例病人，男18例，女42例，平均年齡（32.30±9.41）歲。根據(jù)LN病理類型將病人分為Ⅲ型組12例，Ⅳ型組18例，Ⅴ型組16例，Ⅴ+Ⅳ型組14例。根據(jù)疾病活動性（SLEDAI≥9分定義為SLE疾病活動）將病人分為活動組34例和非活動組26例。另選擇10例腎組織正常的病人作為對照組（腎組織標(biāo)本為外傷手術(shù)標(biāo)本及腎移植供腎活檢標(biāo)本），均無其他原發(fā)性及繼發(fā)性引起腎損害的情況。對照組10例病人，男3例，女7例，平均年齡（30.40±6.45）歲。LN組病人與對照組性別、年齡比較差異均無顯著性（P>0.05）。

1.2血、尿及腎組織標(biāo)本采集

所有研究對象于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集上肢靜脈血3 mL，分離血清置于-80 ℃凍存待用;收集所有研究對象晨起中段尿10 mL，離心后置于-80 ℃凍存待用。LN病人均行腎組織活檢術(shù)采集腎組織標(biāo)本。在穿刺前告知腎組織活檢術(shù)必要性及相關(guān)風(fēng)險，病人及家屬同意后簽訂知情同意書。病人俯臥于硬板床上，在B超下定位，標(biāo)記穿刺部位，常規(guī)皮膚消毒，鋪無菌洞巾，以10 g/L利多卡因局部麻醉，用穿刺針快速取得1 cm左右腎組織1～2條，用40 g/L甲醛固定，石蠟包埋后制成2 μm厚切片。

1.3免疫組織化學(xué)檢測腎組織巨噬細(xì)胞的浸潤

腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，用枸櫞酸鈉修復(fù)液微波熱修復(fù)10 min，冷卻后洗片3次，每次7 min。用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液浸泡組織10 min，洗片后加入10 g/L的BSA 30 μL，37 ℃孵育1 h。洗片后加入CD68單克隆抗體（1∶50，Santa Cruz，美國）30 μL，37 ℃孵育1.5 h。洗片后加入山羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗（1∶500，abcam，英國）30 μL，37 ℃恒溫孵育20 min。洗片后加入DAB底物30 μL避光孵育5 min進(jìn)行顯色，顯色結(jié)束后用自來水輕洗5 min。用蘇木精染核30 s，自來水輕洗5 min。脫水、封片，光鏡下觀察，攝片保存，應(yīng)用圖像軟件進(jìn)行圖像半定量分析。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清、尿液TNF-α水平

應(yīng)用人TNF-α ELISA試劑盒（Elabscience Biotechnology Co.， Ltd），采用雙抗體夾心法測定血清、尿液中TNF-α表達(dá)水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩變量關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)檢測

對照組腎組織中幾乎無巨噬細(xì)胞浸潤（圖1A），LN病人與對照組腎臟比較有明顯的巨噬細(xì)胞浸潤（圖1B～E），巨噬細(xì)胞主要分布于腎小球且呈散在或者簇狀分布，腎小管間質(zhì)中較少浸潤。對照組、LN活動組和LN非活動組CD68+細(xì)胞數(shù)分別為1.26±0.59、45.01±21.43和9.18±2.20。LN病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤程度較對照組明顯增高，且活動組明顯高于非活動組（F=56.085，P<0.01）。不同病理類型組間比較，Ⅳ型組LN 病人腎組織中有明顯巨噬細(xì)胞浸潤，且其浸潤程度與Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型組LN病人比較差異均有顯著意義（F=67.977，P<0.01），而Ⅲ型組和Ⅴ型組LN病人間差異不明顯（圖1F）。

2.2ELISA檢測

LN病人血清、尿液中TNF-α的表達(dá)水平較對照組明顯升高，且活動組明顯高于非活動組（F=50.234、52.982，P<0.01）。不同病理類型組間比較，Ⅳ型組病人血清、尿液中TNF-α水平較Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型組明顯增高，Ⅴ+Ⅳ型組病人尿液中TNF-α水平較Ⅲ型組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.103、68.381，P<0.01）。見表1、2。

2.3腎組織巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平的相關(guān)性

Pearson直線相關(guān)分析顯示，LN病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平有顯著相關(guān)性（r=0.728、0.716，P<0.01）。

3討論

LN是SLE病人最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響SLE病人的預(yù)后，因此探討其具體發(fā)病機(jī)制和尋求新的治療方法尤為重要。LN的臨床表現(xiàn)多樣，從單純性蛋白尿至腎炎綜合征、腎病綜合征、急進(jìn)型腎炎和腎衰竭等[6]，與腎臟病理的多樣性相平行。目前蛋白尿仍是LN病人疾病活動最主要的臨床表現(xiàn)，也是影響病人預(yù)后的重要指標(biāo)。尋找新的相關(guān)生物標(biāo)記物對LN活動性預(yù)測、疾病治療及預(yù)后評估有重要意義。近年來，腎臟疾病中巨噬細(xì)胞的浸潤受到越來越多的關(guān)注，在大多數(shù)腎臟病中巨噬細(xì)胞起著重要作用，巨噬細(xì)胞浸潤與腎組織受損（新月體形成、腎間質(zhì)纖維化等）、尿蛋白水平及腎功能減退等明顯相關(guān)。本課題組前期研究顯示，巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)LN病人腎組織損傷的重要細(xì)胞，與LN病變嚴(yán)重程度有密切關(guān)系[7]，尤其在活動期病人中表現(xiàn)格外明顯，且干預(yù)巨噬細(xì)胞在腎組織的浸潤能夠改善這種腎臟損傷[8]。不同病理類型LN病人，特別是表現(xiàn)為彌漫增殖性病變的Ⅳ型LN病人和表現(xiàn)為膜性病變的Ⅴ型LN病人，其臨床特征和病理表現(xiàn)相差甚大，提示其免疫發(fā)病可能存在不同的機(jī)制。本課題組前期研究顯示，與對照組腎臟相比較，LN病人腎小球中巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多，腎臟中巨噬細(xì)胞的大量浸潤是引起腎組織學(xué)病變的機(jī)制之一[9]。本文研究顯示，LN病人腎臟巨噬細(xì)胞浸潤較對照組明顯增加，且不同病理類型的LN巨噬細(xì)胞浸潤程度不同。Ⅳ型LN的活動性明顯高于其他類型LN，且病人腎組織巨噬細(xì)胞浸潤程度高于Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型LN，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明不同病理類型LN的發(fā)病機(jī)制、疾病活動性及嚴(yán)重程度有很大差異。LN活動組與非活動組巨噬細(xì)胞浸潤亦有明顯差異，提示巨噬細(xì)胞浸潤參與LN發(fā)病且其浸潤程度可能與疾病的活動性有關(guān)[10]。

TNF-α能抑制急性自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞的正常生理作用，致使機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞在發(fā)育過程中出現(xiàn)凋亡異常從而導(dǎo)致自身耐受平衡被破壞，然后通過自分泌途徑誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞因子，激活以及產(chǎn)生一系列自身抗體致使多臟器免疫損傷。國內(nèi)外新近研究證實(shí)，TNF-α在自身免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的調(diào)控中至關(guān)重要[11-12]，且在LN的異常免疫調(diào)節(jié)中亦起到了重要的作用，與LN的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著密切聯(lián)系[13]，其可能成為早期預(yù)測LN發(fā)生的相關(guān)標(biāo)志。本文的研究結(jié)果顯示，LN病人血清和尿液的TNF-α表達(dá)水平明顯升高，且與腎組織巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，活動期的LN與非活動期相比較，TNF-α表達(dá)亦明顯升高，表明腎組織TNF-α高表達(dá)在LN的發(fā)病過程中同樣發(fā)揮重要作用[14]，并與LN的疾病活動性密切相關(guān)，提示TNF-α可能通過促進(jìn)LN病人腎臟的巨噬細(xì)胞浸潤引起疾病發(fā)生及腎臟損傷。

綜上所述，LN病人發(fā)病與免疫調(diào)節(jié)失衡有密切聯(lián)系，其中包括巨噬細(xì)胞的腎臟浸潤，且浸潤程度與疾病活動性密切相關(guān)。LN病人巨噬細(xì)胞浸潤與血清、尿液的TNF-α水平呈正相關(guān)，提示血清、尿液TNF-α水平可能成為判斷病人疾病活動性及嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。雖然巨噬細(xì)胞與LN的發(fā)病機(jī)制有密切聯(lián)系，其中包括腎臟足細(xì)胞的損傷，但是不同表型巨噬細(xì)胞的浸潤對腎臟損傷的影響在國內(nèi)外研究甚少，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步研究腎臟不同表型巨噬細(xì)胞浸潤與LN病人足細(xì)胞損傷關(guān)系，為LN的活動性預(yù)測及疾病治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]WANG H P， WANG C Y， PAN Z L， et al. Relationship between clinical and immunological features with magnetic resonance imaging abnormalities in female patients with neuropsychiatric systemic lupus erythematosus[J].? Chin Med J， 2016，129（5）：542-548.

[2]MOHAN C， PUTTERMAN C. Genetics and pathogenesis of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis[J].? Nat Rev Nephrol， 2015，11（6）：329-341.

[3]YUNG S， YAP D Y， CHAN T M. Recent advances in the understanding of renal inflammation and fibrosis in lupus nephritis[J].? F1000Research， 2017，6：874.

[4]KALLIOLIAS G D， IVASHKIV L B. TNF biology， pathogenic mechanisms and emerging therapeutic strategies[J].? Nat Rev Rheumatol， 2016，12（1）：49-62.

[5]HOCHBERG M C. Updating the American college of rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J].? Arthritis & Rheumatism， 1997，40（9）：1725.

[6]YAP D Y， CHAN T M. Lupus nephritis in Asia： clinical features and management[J].? Kidney Dis Basel Switz， 2015，1（2）：100-109.

[7]孫益婷，王祥花，李明慧，等. 狼瘡腎炎患者腎組織巨噬細(xì)胞浸潤與骨橋蛋白表達(dá)的關(guān)系[J].? 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志， 2019，23（3）：175-178，后插2.

[8]CHALMERS S A， CHITU V， HERLITZ L C， et al. Macrophage depletion ameliorates nephritis induced by pathogenic antibodies[J].? J Autoimmun， 2015，57：42-52.

[9]王瑩，李明慧，張巖，等. 狼瘡性腎炎患者足細(xì)胞損傷與腎組織巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系[J]. 北京大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2019，51（4）：723-727.

[10]ZIZZO G， GUERRIERI J， DITTMAN L M， et al. Circulating levels of soluble MER in lupus reflect M2c activation of monocytes/macrophages， autoantibody specificities and disease activity[J].? Arthritis Res Ther， 2013，15（6）：R212.

[11]趙媛，王宏亮，張麗華，等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血IL-17、TNF-α和INF-γ表達(dá)水平及臨床意義[J].? 解放軍醫(yī)藥雜志， 2017，29（6）：86-88.

[12]FLEISCHER V， SIEBER J， FLEISCHER S J， et al. Epratuzumab inhibits the production of the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α， but not the regulatory cytokine IL-10， by B cells from healthy donors and SLE patients[J].? Arthritis Res Ther， 2015，17：185.

[13]凌磊，皮肖冰，余旸弢，等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清干擾素-α的水平變化及其臨床意義[J].? 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2016，32（1）：106-108.

[14]CIGNI A， PILERI P V， FAEDDA R， et al. Interleukin 1， interleukin 6， interleukin 10， and tumor necrosis factor α in active and quiescent systemic lupus erythematosus[J].? Journal of Investigative Medicine， 2014，62（5）：825-829.

（本文編輯 馬偉平）