席向東 陳德勝 楊超 王碩 宋國(guó)瑞 張晨 劉子歌

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)（artificial joint replacement，AJR）因其較為顯著的臨床效果而被廣大骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者及醫(yī)生所接受，然而其術(shù)后并發(fā)癥無(wú)菌性松動(dòng)（aseptic loosening，AL）的發(fā)生仍然是不容忽視的問(wèn)題，患者因AL 需要多次進(jìn)行翻修手術(shù)而倍感痛苦[1]。引起AL 的原因有很多，如今被廣泛接受的是磨損顆粒介導(dǎo)的骨溶解理論，其主要內(nèi)容是關(guān)節(jié)假體產(chǎn)生的磨損顆粒刺激假體周圍界膜組織，導(dǎo)致機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的激活以及一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，最終導(dǎo)致炎性因子如腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor- ，TNF- ）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）等的大量產(chǎn)生，炎性因子不僅作用于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，造成破骨/成骨的失衡，其自身也參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終導(dǎo)致了假體周圍骨溶解[2-3]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是近些年研究的新熱點(diǎn)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 在破骨細(xì)胞的分化、成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，除此之外其可以直接參與細(xì)胞外基質(zhì)及假體周圍骨質(zhì)的降解，導(dǎo)致無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生[4-5]。本研究通過(guò)觀察TNF- 、IL-1 和MMP-9 在關(guān)節(jié)假體周圍界膜組織和骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達(dá)，探索TNF- 、IL-1 和MMP-9 在假體無(wú)菌性松動(dòng)中的作用及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)2017年1 月至2018年12 月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科的住院患者進(jìn)行分組。將術(shù)前診斷為無(wú)菌性松動(dòng)患者且行初次膝關(guān)節(jié)翻修的患者納入無(wú)菌性松動(dòng)組，收集術(shù)中切除的界膜組織；將術(shù)前診斷為骨性關(guān)節(jié)炎且行初次膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者納入骨性關(guān)節(jié)炎組，收集術(shù)中切除的滑膜組織。

無(wú)菌性松動(dòng)組共計(jì)20 例，其中男6 例，女14 例，年齡55 ～70 歲。骨性關(guān)節(jié)炎組共計(jì)30 例，其中男8 例，女22例，年齡60 ～75 歲。本研究經(jīng)本院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2015-019），所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：MMP-9 抗體（批號(hào)ab38898）、TNF- 抗體（批號(hào)ab9739）、IL-1 抗體（批號(hào)ab9722）以及辣根酶標(biāo)記二抗（批號(hào)ZB-2301）（Abcam 公司，英國(guó)）；HE 染色試劑（銀川偉博鑫生物技術(shù)有限公司）。主要儀器：YB-6LF 石蠟包埋機(jī)、TST1200 包埋專用冷臺(tái)、YT-7F 型攤片烤片機(jī)（湖北省亞光公司）；RM2255 石蠟切片機(jī)（Leica 公司，德國(guó)）;H6203i 倒置顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）；PIPS-2020 超清晰度病理圖文分析系統(tǒng)（Olympus 公司，日本）。

1.3 研究方法

將術(shù)中取出的20 例假體周圍界膜組織標(biāo)本及30 例膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織標(biāo)本制成切片后部分用于HE 染色，鏡下觀察2 種不同組織的形態(tài)性差異。部分切片用于MMP-9、TNF- 和IL-1 的免疫組織化學(xué)染色，鏡下觀察三者的染色情況，黃色或棕黃色為陽(yáng)性染色，高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件測(cè)定三者的平均積分光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)對(duì)兩組中MMP-9、TNF- 和IL-1 的表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用積矩相關(guān)性分析對(duì)MMP-9、TNF- 和IL-1 在兩種不同組織中平均積分光密度值進(jìn)行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色結(jié)果

無(wú)菌性松動(dòng)組：假體界膜可見(jiàn)大量磨損顆粒填充其中，組織結(jié)構(gòu)混亂、層次不清，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。界膜組織中部分區(qū)域可見(jiàn)大量磨損顆粒的聚集，部分區(qū)域磨損顆粒較少。骨性關(guān)節(jié)炎組：滑膜組織結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，呈現(xiàn)為慢性炎癥的表現(xiàn)，整個(gè)滑膜組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞的填充，滑膜組織部分區(qū)域可見(jiàn)明顯的新生血管增生并聚集的表現(xiàn)。

圖1 兩組HE 染色（×100）：A.無(wú)菌性松動(dòng)組；B.骨性關(guān)節(jié)炎組

2.2 兩組中MMP-9、TNF- 和IL-1 的平均積分光密度

無(wú)菌性松動(dòng)組中平均積分光密度MMP-9 為（0.4129±0.0561）、TNF- 為（0.3099±0.0597）、IL-1 為（0.2482±0.0392），骨性關(guān)節(jié)炎組中平均積分光密度MMP-9 為（0.3882±0.0822）、TNF-為（0.2928±0.1345）、IL-1 為（0.2263±0.0880）。兩組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 MMP-9、TNF- 和IL-1 在兩組中的平均積分光密度比較

2.3 兩組中TNF- 、IL-1 和MMP-9 的Pearson 相關(guān)性分析

無(wú)菌性松動(dòng)組中MMP-9 和TNF- 相關(guān)系數(shù)r=0.916，P＜0.01，MMP-9 和IL-1 相關(guān)系數(shù)r=0.606，P＜0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈正相關(guān)性（見(jiàn)表2）。骨性關(guān)節(jié)炎組中，MMP-9 和TNF- 相關(guān)系數(shù)r=0.830，P＜0.01，MMP-9 和IL-1相關(guān)系數(shù)r=0.734，P＜0.01，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈正相關(guān)性（見(jiàn)表3）。

表2 無(wú)菌性松動(dòng)組中TNF- /IL-1 與MMP-9 的Pearson相關(guān)性分析

表3 骨性關(guān)節(jié)炎組中TNF- /IL-1 與MMP-9 的Pearson相關(guān)性分析

3 討論

至今OA 的發(fā)病機(jī)制仍不明確，遺傳、年齡、肥胖等多種因素均可以影響其進(jìn)展[7]，對(duì)于關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體無(wú)菌性松動(dòng)的研究也有很多，目前以磨損顆粒介導(dǎo)的骨溶解理論被廣泛接受，其主要認(rèn)為關(guān)節(jié)假體在長(zhǎng)期的使用過(guò)程中產(chǎn)生的磨損顆粒介導(dǎo)了一系列炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致假體無(wú)菌性松動(dòng)的發(fā)生[8]。

引起炎癥性骨溶解的原因有很多，但不管病因和細(xì)胞環(huán)境如何，破骨細(xì)胞都是骨降解細(xì)胞。炎性細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞形成和功能的影響是促進(jìn)局灶性骨溶解的重要因素之一，免疫細(xì)胞及其產(chǎn)物影響破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的活動(dòng)并決定骨量和強(qiáng)度。20 世紀(jì)70年代，人們就發(fā)現(xiàn)了免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)之間的這種關(guān)系，受刺激的單核細(xì)胞可以產(chǎn)生分解代謝的骨吸收因子并證實(shí)該因子為IL-1[9-10]。在生理?xiàng)l件下，成骨細(xì)胞表達(dá)并釋放RANKL，和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK 結(jié)合后促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化[11]，高劑量的RANKL 具有破骨作用，而低劑量的RANKL 可能會(huì)促進(jìn)骨形成[12]。RANKL 通過(guò)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）激活RANK，RANKL/RANK 信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)MAPK 激酶和NF- B，最終激活破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NFATc1[13-15]。IL-1 大量存在于炎性組織中，可誘導(dǎo)并與TNF- 結(jié)合，促進(jìn)炎癥性骨溶解[16]。在炎性組織中，TNF- 可增強(qiáng)滑膜成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-1，IL-1 反過(guò)來(lái)刺激RANK 和RANK 及其自身受體的表達(dá)[17]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是主要負(fù)責(zé)切割細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等相關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白酶家族，并產(chǎn)生生物活性分子[18]。MMP-9是破骨細(xì)胞表達(dá)和分泌最多的MMP，但其功能尚不完全清楚，破骨細(xì)胞中的RANKL 和維生素D 可以調(diào)節(jié)MMP-9 的表達(dá)。MMP-9 通過(guò)作用于相關(guān)底物將無(wú)活性的前體TNF-轉(zhuǎn)化為活性細(xì)胞因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成和存活。除此之外，MMP-9 降解IL-1 并促進(jìn)破骨細(xì)胞融合、存活及其活性[19-21]。炎性細(xì)胞因子TNF- 、IL-1、MMP-9 彼此之間相互作用、相互影響，并通過(guò)相關(guān)的信號(hào)通路作用于破骨細(xì)胞及其他骨細(xì)胞的表達(dá)，最終引起骨溶解。

磨損顆粒通過(guò)刺激界膜組織中的細(xì)胞（主要為巨噬細(xì)胞），使炎性細(xì)胞因子TNF- 、IL-1 等的表達(dá)增加，并激活不同信號(hào)通路導(dǎo)致破骨/成骨失衡，最終發(fā)生骨溶解和無(wú)菌性松動(dòng)，參與假體無(wú)菌性松動(dòng)的信號(hào)通路有RANKL/RANK/OPG 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路等[22-23]。趙建寧等[24]通過(guò)建立小鼠模型，采用ELISA 方法檢測(cè)TNF-

在對(duì)照組和CoCrMo 組的分泌水平，結(jié)果顯示CoCrMo 組中TNF- 的分泌水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。金群華等[25]研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子的蛋白及mRNA 在無(wú)菌性松動(dòng)人工髖關(guān)節(jié)界膜組織中的表達(dá)明顯高于股骨頸骨折后髖關(guān)節(jié)滑膜組織（P＜0.05）。馬建兵等[26]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)聚乙烯微粒較其他微粒（如金屬微粒、水泥微粒等）刺激性更強(qiáng)，刺激巨噬細(xì)胞釋放更多的TNF- ，導(dǎo)致骨溶解加劇。

本次研究納入20 例無(wú)菌性松動(dòng)膝關(guān)節(jié)假體界膜組織標(biāo)本（無(wú)菌性松動(dòng)組）和30 例骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織標(biāo)本（骨性關(guān)節(jié)炎組），HE 染色可見(jiàn)無(wú)菌性松動(dòng)組中較為明顯的炎性表現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎組中亦可見(jiàn)慢性炎癥表現(xiàn)，表明磨損顆粒促進(jìn)了炎癥的表達(dá)。同時(shí)對(duì)兩組中的TNF- 、IL-1 和MMP-9 的表達(dá)差異和相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)菌性松動(dòng)組中TNF- 、IL-1 和MMP-9 的表達(dá)稍高于骨關(guān)節(jié)炎組，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），臨床上大多數(shù)無(wú)菌性松動(dòng)患者常常發(fā)生在術(shù)后早期并行手術(shù)治療，所以患者往往感覺(jué)關(guān)節(jié)疼痛、不穩(wěn)的時(shí)候即入院復(fù)查，這也避免了假體的進(jìn)一步磨損，這也可能是本次實(shí)驗(yàn)中TNF- 、IL-1 和MMP-9 的表達(dá)無(wú)明顯差異的主要原因。對(duì)于TNF- 和MMP-9，以及IL-1 和MMP-9 之間的相關(guān)性研究前面已做闡述，眾多研究也都證明了其存在相關(guān)性[27-28]。本次研究中也對(duì)TNF- 和MMP-9，以及IL-1 和MMP-9 行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示無(wú)論在無(wú)菌性松動(dòng)組或骨性關(guān)節(jié)炎組中炎性因子TNF- 和IL-1 與MMP-9 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均呈正相關(guān)性，磨損顆粒刺激了可能促進(jìn)了TNF- 和IL-1 的表達(dá)，但未在不同組織中引起統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所以通過(guò)減少磨損顆粒的刺激以及阻斷炎性因子和MMP-9 之間的相關(guān)性就可能減緩無(wú)菌性松動(dòng)或者骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進(jìn)程。