李 紅,劉成倩,嚴(yán)華祥,孫鳳萍,高 駿,姚惠娟,易建中

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106)

溶菌酶(Lysozyme)又稱為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶、胞壁質(zhì)酶,是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶[1],對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌能力最強(qiáng),也能抑制革蘭氏陰性菌和真菌,還具有抗氧化能力。 溶菌酶作為一種生物體內(nèi)的非特異性免疫因子,在抑殺病原體時(shí)不易產(chǎn)生抗藥性,具有無毒、無害、無殘留、抗菌譜廣、活性穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)良抗菌特性[2]。 溶菌酶不僅在生物體內(nèi)有非特異性免疫功能,哺乳動(dòng)物還可以通過乳汁將這種功能傳遞給幼崽,提高幼崽的抗病力;家禽通過蛋清傳遞給種蛋,提高胚胎發(fā)育的抵抗力。 溶菌酶在食品工業(yè)(防腐劑)[3-4]、醫(yī)藥(酶類抗菌藥[5-6],抗病毒藥[7-8])、飼料(替代抗生素[9-12])和生物工程(生物酶[13])等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用,并有替代抗生素的趨勢(shì)。

雞蛋中的溶菌酶含量最高,占蛋清蛋白的3.5%,是提取溶菌酶的最佳來源[14-15]。 蛋清中的溶菌酶含量越高,酶活力越強(qiáng),越有利于雞蛋的儲(chǔ)藏,因此測(cè)定雞蛋蛋清中的溶菌酶對(duì)我國溶菌酶生產(chǎn)、禽蛋產(chǎn)品加工有重要的指導(dǎo)作用,其也是評(píng)定雞蛋品質(zhì)的重要參數(shù)之一。 目前,蛋清中溶菌酶的定量測(cè)定還沒有一個(gè)較便捷的方法。 本研究通過制備溶菌酶抗體,旨在提供一種檢測(cè)雞蛋清中溶菌酶的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系

SPF 級(jí)6—8 周齡雄性BALB∕c 小鼠購自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院;SP2∕0 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50 ×HAT、50 ×HT、PEG4000 鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotype Reagent)和雞蛋溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma-Aldrich 公司;DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司;胎牛血清購自美國GIBCO 公司;Protein G Resin 購自金斯瑞生物科技有限公司;增強(qiáng)型HRP-DAB 底物顯色試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG、FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 均購自美國Jackson 公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)。

1.3 SDS-PAGE 檢測(cè)溶菌酶

參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南,進(jìn)行SDS-PAGE[16],其中分離膠和積層膠濃度分別為8%和5%。

1.4 動(dòng)物免疫及血清抗體效價(jià)檢測(cè)

選取3 只6—8 周齡健康BALB∕c 小鼠(編號(hào)為No.1—No.3),按每只小鼠100 μg 的劑量進(jìn)行腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射,免疫3 次。 首次免疫用弗氏完全佐劑,其余免疫用弗氏不完全佐劑。 免疫前和每次免疫后2 周尾靜脈采血,檢測(cè)抗體滴度。 融合前5 d 用相同劑量和方法對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。 溶菌酶蛋白以2 μg∕mL 的濃度包被酶標(biāo)板,并用間接ELISA 方法檢測(cè)血清抗體水平。

1.5 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆化

細(xì)胞融合及亞克隆參考文獻(xiàn)[17]。 無菌采集小鼠脾臟,將脾細(xì)胞按8∶1的比例與SP2∕0 細(xì)胞充分混合,用PEG4000(500 g∕L)進(jìn)行融合。 按照脾細(xì)胞2 ×106個(gè)∕mL、100 μL∕孔計(jì)算,輕輕加入預(yù)溫的HT 培養(yǎng)液。 24 h 后,每孔補(bǔ)加含有2 倍量A 的HAT 培養(yǎng)液,每孔100 μL。 4 d、7 d 和14 d 時(shí)分別半量換HAT 培養(yǎng)液、HT 培養(yǎng)液和普通DMEM 培養(yǎng)液。 每天觀察細(xì)胞狀態(tài),標(biāo)記融合細(xì)胞,待克隆細(xì)胞生長至孔底1∕4面積以上時(shí),利用間接ELISA 法對(duì)上清液進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè),篩選陽性雜交瘤細(xì)胞,用有限稀釋法篩選單克隆,并擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存,直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽性。

1.6 腹水制備及純化

取18—22 周齡健壯的雌性BALB∕c 小鼠,每只小鼠腹腔注射500 μL 高壓滅菌的石蠟油,5 d 后腹腔注射處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞1 ×106—2 ×106個(gè)∕只,5—7 d 后,選擇腹腔明顯膨脹,行動(dòng)不便的小鼠,將注射器針頭插入小鼠腹腔內(nèi)取腹水。 4 ℃、12 000 r∕min 離心15 min,去除雜質(zhì)。 逐滴加入飽和硫酸銨,慢慢攪拌2 h,4 ℃、12 000 r∕min 離心15 min,棄上清,沉淀用0.01 mol∕L 的PBS(pH 7.2)重懸。 利用Protein G Resin 純化單克隆抗體,紫外吸收法測(cè)定濃度,SDS-PAGE 電泳分析其純度。

1.7 MAb 效價(jià)測(cè)定

利用2 μg∕mL 雞蛋溶菌酶包被酶標(biāo)板,細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水做連續(xù)倍比稀釋,用ELISA 方法測(cè)定上清和腹水中MAb 的效價(jià)。 陰性對(duì)照是SP2∕0 細(xì)胞上清及免疫前小鼠血清。 P∕N 不低于2.1 者視為陽性。

1.8 單抗亞型鑒定

選用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,根據(jù)操作說明使用ELISA 方法鑒定單抗亞型。

1.9 MAb 特異性鑒定

1.9.1 ELISA 方法

雞蛋溶菌酶和CD163 截短蛋白M-1(對(duì)照蛋白)以2 μg∕mL 濃度包被酶標(biāo)板,SP2∕0 細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照,每孔100 μL,常規(guī)間接ELISA 方法檢測(cè)該MAb 的抗原特異性。

1.9.2 Weston Blot 方法

8 μg 雞蛋溶菌酶經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,4 ℃封閉過夜。 3E4 單克隆抗體作為一抗,HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG 作為二抗,DAB 顯色,Western Blot 鑒定該MAb 的抗原特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清抗體效價(jià)的檢測(cè)

采集3 只小鼠三免后第14 天的血清。 將免疫前采集的血清(Pre)、三免后采集的血清分別稀釋102倍、103倍、104倍和105倍,檢測(cè)其抗雞蛋溶菌酶抗體的效價(jià)。 由圖1 可知,三次免疫后,小鼠血清抗體水平均達(dá)到1.0 ×105,加強(qiáng)免疫后可以進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立及MAb 亞型鑒定

三次細(xì)胞融合的融合率分別為17.7%、19.4%和78.2%,經(jīng)過篩選、克隆等,最后獲得一株特異性和親和力高,并能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為3E4。 使用小鼠MAb 亞型鑒定試劑盒檢測(cè),經(jīng)酶標(biāo)儀讀取450 nm 處吸光度值,判定3E4 抗體屬于IgG2b 亞型(表1)。

圖1 三免后小鼠血清抗體效價(jià)的ELISA 檢測(cè)Fig.1 ELISA detection of mouse serum after 3rd immunization

表1 MAb 亞型鑒定Table 1 MAb subtype identification

2.3 MAb 的效價(jià)測(cè)定及分離純化

收取單抗3E4 小鼠腹水16 mL。 細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水中抗體效價(jià)分別可達(dá)到2 560和1.0 ×106。 腹水經(jīng)Protein G Resin 純化,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得3E4 的抗體濃度為1.8 mg∕mL。 SDS-PAGE 分析顯示,純化后MAb 主要有兩條蛋白帶:分子量約為50 ku 的重鏈帶和25 ku 的輕鏈帶。

2.4 3E4 單抗的特異性檢測(cè)

由表2 可知,單克隆抗體3E4 與雞蛋溶菌酶蛋白相互作用,與M-1 蛋白不相互作用,說明3E4 單抗具有較高抗原特異性。 Western Blot 結(jié)果顯示3E4 與雞蛋溶菌酶特異性結(jié)合(圖2)。 綜上,認(rèn)為3E4 單克隆抗體具有高度的抗原特異性。

表2 單抗特異性的間接ELISA 方法檢測(cè)(OD450 nm)Table 2 Detection of MAb specificity by iELISA(OD450 nm)

圖2 Western blot 檢測(cè)MAb 的抗原特異性Fig.2 Detection the specificity of MAb by Western blot

3 討論與結(jié)論

溶菌酶在自然界中分布甚廣,動(dòng)物(鳥類、家禽的蛋清和哺乳動(dòng)物的眼淚、唾液、血漿、乳汁、胎盤以及體液、組織細(xì)胞等),植物(卷心菜、蘿卜、無花果)和微生物中處處可見[18]。 溶菌酶作為生物體內(nèi)非特異性免疫的主要成員之一,具有與抗生素不同的抗菌機(jī)制和抑制病毒作用,其對(duì)人體無毒性,在體內(nèi)無殘留,是一種安全性非常高的食品保鮮劑、營養(yǎng)保健品和藥品。 在倡導(dǎo)綠色食品的今天,受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注和重視,具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景[19]。 蛋清中溶菌酶含量越高,其酶活力越強(qiáng),越利于雞蛋的保存。 因此測(cè)定雞蛋蛋清中溶菌酶對(duì)我國溶菌酶生產(chǎn)、禽蛋產(chǎn)品加工以及蛋品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要的指導(dǎo)作用[20]。 瓊脂板擴(kuò)散法、比濁法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法是比較常用的溶菌酶檢測(cè)方法。 瓊脂板擴(kuò)散法因測(cè)定時(shí)間長,操作復(fù)雜,靈敏度低,目前已少用[21]。 比濁法主要是檢測(cè)溶菌酶的活性,而不是溶菌酶的凈含量。 雖然可以根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)品的活力進(jìn)行轉(zhuǎn)換,但是不同物種的溶菌酶分子量和活力不同,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的活力進(jìn)行轉(zhuǎn)換,其結(jié)果不夠精準(zhǔn);同時(shí),比濁法使用的微球菌懸液體是不均勻體系,測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差[22-23]。 ELISA 方法是利用免疫反應(yīng)(即抗原—抗體反應(yīng))的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性,實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的檢測(cè),是一種定性和定量相結(jié)合的技術(shù)。 本研究是利用溶菌酶抗原與溶菌酶特異性抗體進(jìn)行抗原抗體特異性反應(yīng),且反應(yīng)顏色深淺和樣本中溶菌酶濃度呈比例關(guān)系的原理來測(cè)定溶菌酶凈含量。 ELISA 方法測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)較小,且易于實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè),具有微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便和安全等特點(diǎn)。 本試驗(yàn)獲得了一株抗雞蛋溶菌酶的高特異性單克隆抗體,為ELISA 檢測(cè)方法的建立提供了關(guān)鍵的素材,為后期制備檢測(cè)雞蛋溶菌酶含量的ELISA 試劑盒奠定了基礎(chǔ)。