章 慧,豐東升,張唯誼,陳美蓮,王藝嬌

(上海市農產(chǎn)品質量安全中心,農業(yè)部食品質量監(jiān)督檢驗測試中心(上海),上海201708)

農藥是把雙刃劍,在提高農作物產(chǎn)量保證人類食物供給方面做出了巨大的貢獻,但若使用不當,農藥殘留問題會嚴重危害廣大人民群眾的身體健康。 在合作社加農戶的種植方式下,施肥用藥難以監(jiān)管,特別是葉菜類蔬菜,流通領域停留時間極短,若不經(jīng)農藥殘留檢測就進行銷售,極易導致食品安全事故。 因此,利用農藥殘留快速檢測技術對產(chǎn)地輸出及外地流入當?shù)厥袌龅氖卟藢嵤┤姹O(jiān)控,實現(xiàn)安全監(jiān)控“全覆蓋”意義重大。

目前,廣泛應用的農藥殘留快速檢測方法為酶抑制率法,受酶特異性的影響,該方法主要用于檢測有機磷和氨基甲酸酯兩類農藥[1],但該方法易受酶試劑和酶活力的影響,檢測結果可信度較低[2]。 膠體金免疫層析技術是20 世紀末發(fā)展起來的一種固相標記免疫檢測技術[3],具有簡單、快速、準確、無污染、成本低等優(yōu)點,被廣泛應用于醫(yī)學檢測、食品安全及動物疫病診斷等領域[4]。 但目前應用膠體金免疫層析法檢測蔬菜農藥殘留的試紙種類較少,制約了該檢測技術的進一步推廣[5]。

噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺均為《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]在蔬菜產(chǎn)品中有限量規(guī)定的農藥品種,本項目對膠體金法快速檢測蔬菜中噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺的技術開展應用研究,旨在為農產(chǎn)品質量安全監(jiān)管和農產(chǎn)品生產(chǎn)者安全自檢工作提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機在市場上購買結球甘藍、辣椒、黃瓜、番茄、芹菜、西葫蘆、苦苣、紅米莧、韭菜、大蒜、菜薹、結球萵苣、生菜、洋蔥、蔥、菜豆、胡蘿卜、馬鈴薯各3 份,液相色譜-串聯(lián)質譜法確認噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺檢出為陰性后,再用膠體金快速試紙條驗證。 噠螨靈快速檢測試紙條(YRSPN1028)、咪鮮胺快速檢測試紙條(YRSPN1025)、嘧霉胺快速檢測試紙條(YRSPN1017)購自深圳市易瑞生物技術股份有限公司;噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 儀器與設備

膠體金法讀數(shù)儀YR-100,深圳市易瑞生物技術股份有限公司;液相色譜-質譜(LC-MS),沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 膠體金法

原理:在檢測微孔中凍干金標抗體,在硝酸纖維素膜的檢測線(T 線)和對照線(C 線)處分別包被噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺抗原和羊抗鼠IgG 二抗。 樣本中若含有噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺,則在微孔溫育過程中與膠體金標記的單克隆抗體結合,從而抑制金標抗體與硝酸纖維素膜上包被的噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺抗原的結合。

前處理:每種蔬菜樣品稱取(2 ±0.1)g,剪碎或攪碎后分別加入到15 mL 或50 mL 離心管中;加入8 mL YRSPN 樣品通用提取液,充分震蕩混勻,即為待測液。 重復3 次。

檢測:從配套的檢測試劑盒里取出紅色微孔試劑,依次加入200 μL 待測液,用一次性吸管上下抽吸混勻后反應3 min(20—40 ℃)。 取出試紙條,將其插入上述紅色微孔中,反應6 min(20—40 ℃)。 從微孔中取出試紙條,輕輕刮去其下端的吸水海綿,并進行結果判讀。 若T 線顏色較C 線顏色深,則結果為陰性(未檢出);若T 線顏色較C 線顏色淺,或T 線不顯色,則結果為陽性(檢出);若T 線、C 線均不顯色則檢出結果無效。

1.3.2 液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法

噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺的檢測按照《水果和蔬菜中450 種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質譜法》(GB∕T 20769—2008)[7]規(guī)定的方法進行。

1.4 靈敏度試驗

《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]中對噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺在蔬菜中的殘留量均有規(guī)定。 本試驗針對三種農藥在各類蔬菜中的限量標準,每種蔬菜均設置4 個加標濃度,即本底濃度(空白)、1∕2 限量值濃度或產(chǎn)品標識檢出限濃度(如產(chǎn)品檢出限即為該藥物在某種蔬菜上的限量值即設定1∕2 限量值濃度,如產(chǎn)品檢出限低于該藥物在某種蔬菜上的限量值則設定產(chǎn)品標識檢出限濃度)、限量值濃度和2 倍限量值濃度。 除標準中明確限量的蔬菜品種外,另選幾種市面上常見的蔬菜作為驗證樣品開展靈敏度試驗。 每份試驗樣品均做3 個重復。 每種農藥各選定9 種蔬菜做為靈敏度試驗樣品。

1.5 實物陽性樣品驗證試驗

選擇生產(chǎn)過程中未施用過農藥的生菜,對其噴灑主要藥效成分為噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的農藥品種,噴灑3 d 后采摘,將其運送到實驗室,先用液相色譜-串聯(lián)質譜法對樣品中農藥殘留的含量進行測定,再將樣品稀釋到產(chǎn)品最低檢出限的0.5 倍、1 倍、2 倍水平。 噴灑了不同農藥的基質均做3 個平行,每個檢出水平做10 個平行。

1.6 交叉反應測試

噠螨靈、咪鮮胺沒有結構類似物,嘧霉胺的結構類似物為嘧菌環(huán)胺,因此選擇嘧菌環(huán)胺、克百威、毒死蜱、多菌靈、啶蟲脒、吡蟲啉、甲氰菊脂、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利共10 種農藥開展交叉反應測試。 將克百威、毒死蜱、多菌靈、啶蟲脒、吡蟲啉、甲氰菊脂、溴氰菊酯、百菌清、腐霉利這9 種農藥配制成為濃度均為20 μg∕mL 的混合標準儲備液。 再將混合標準儲備液分別稀釋到2.00 mg∕kg、1.00 mg∕kg、0.50 mg∕kg,待用。 用噠螨靈、咪鮮胺、嘧霉胺膠體金試紙條分別測試不同濃度的混合標準溶液,觀察是否有交叉反應。 另將嘧菌環(huán)胺配置成0.50 mg∕kg 的標準溶液,用嘧霉胺膠體金試紙條進行測試,觀察是否有交叉反應。

1.7 結果評價

按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《食品快速檢測方法評價技術規(guī)范》,評價膠體金方法的靈敏度、特異性、假陽∕陰性率及與參比方法的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同基質的靈敏度

由表1—3 可知,不同蔬菜基質中噠螨靈的檢出限均能達到2.0 mg∕kg,咪鮮胺的檢出限均能達到1.0 mg∕kg,嘧霉胺的檢出限能達到0.05 mg∕kg,3 種農藥驗證的檢出限均能達到與膠體金試劑條說明書中描述的最低水平。

表1 噠螨靈的靈敏度試驗結果(n=3)Table 1 Sensitivity test results of pyridaben

2.2 實驗室加標假陽性率

隨機在市場上抽取9 種蔬菜各3 份,液相色譜-串聯(lián)質譜法確認為陰性后再用膠體金快速試紙條進行檢測以驗證其假陽性率,結果見表4,噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陽性率均為0%。

2.3 實驗室加標假陰性率

準確稱取噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺標準品,用甲醇溶解,均配置成濃度為100 μg∕mL 的標準溶液,再將標準溶液加入到已確認為陰性的蔬菜樣品中,使其在蔬菜樣品中的終濃度分別為2.00 mg∕kg、1.00 mg∕kg、0.50 mg∕kg,然后用膠體金試紙條進行加標驗證,結果見表5。 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陰性率均為0%。

表2 咪鮮胺的靈敏度試驗結果(n=3)Table 2 Sensitivity test results of prochloraz

表3 嘧霉胺的靈敏度試驗結果(n=3)Table 3 Sensitivity test results of pyrimethanil

2.4 實物陽性樣品

如表6 所示,實物陽性樣品驗證噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺殘留的假陽性率均為0%,噠螨靈和嘧霉胺假陰性率均為0%,僅咪鮮胺在1 mg∕kg 測試濃度下有1 例出現(xiàn)假陰性,膠體金法檢測3 種農藥殘留與參比方法相比均無顯著性差異(χ2＜3.84)。

2.5 交叉反應測試

用100 根噠螨靈膠體金試紙條測試1.6 中配置的2.00 mg∕kg 混合標準溶液,結果均為陰性;用100 根咪鮮胺膠體金試紙條測試1.6 中配置的1.00 mg∕kg 混合標準溶液,結果均為陰性;用100 根嘧霉胺膠體金試紙條1.6 中配置的0.05 mg∕kg 混合標準溶液,結果均為陰性。 用100 根嘧霉胺膠體金試紙條進行測試0.50 mg∕kg 的嘧菌環(huán)胺標準溶液,結果有12 根試紙條顯示陽性,交叉反應率為12%。

表4 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陽性率(n=3)Table 4 The false positive rate of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

表5 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的假陰性率(n=3)Table 5 The false negative rate of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

表6 噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的實物陽性樣品的驗證結果Table 6 The verification results of physical positive samples of pyridaben,prochloraz,pyrimethanil

3 結論與討論

目前,噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的檢測多采用氣相色譜或液相色譜法[8-10],該類方法不僅操作復雜,檢測時間長,還必須在固定的實驗室中操作,無法滿足基層農產(chǎn)品質量安全監(jiān)管的需要。 本研究表明,膠體金法快速檢測蔬菜中噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的殘留,其檢測結果與液相色譜法串聯(lián)質譜法檢測結果相比無顯著性差異,且更為簡便、快速,15 分鐘內即可完成一件樣品從前處理到讀取結果的全部檢測工作。另外,該方法的靈敏度較高,基本能滿足一般基質中噠螨靈、咪鮮胺和嘧霉胺的檢測限量要求,但是,《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]中規(guī)定黃瓜中噠螨靈的殘留限量標準為0.1 mg∕kg,而膠體金產(chǎn)品的檢出限僅能達到2.0 mg∕kg;大蒜中咪鮮胺的殘留限量值為0.1 mg∕kg,而產(chǎn)品檢出限僅能達到1.0 mg∕kg,這會導致實際應用中部分陽性樣品的漏檢。 另外,《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)[6]中規(guī)定薹和辣椒中咪鮮胺的殘留限量值為2.0 mg∕kg,而該產(chǎn)品檢出限為1.0 mg∕kg;除馬鈴薯中嘧霉胺的殘留限量值與產(chǎn)品檢出限相同,為0.05 mg∕kg 外,其他蔬菜的限量值均大于該檢出限,這會造成檢出結果假陽性率偏高,而檢出的陽性樣品往往需要送到專業(yè)的第三方實驗室用儀器方法進行確認,容易耽誤產(chǎn)品上市時間,失去快速檢測的意義。 因此建議針對限量值不同的蔬菜開發(fā)針對性的檢測產(chǎn)品,產(chǎn)品的檢出限不能過高或過低,檢出限達到限量值的水平即可,這樣更利于基層監(jiān)測人員第一時間判斷檢測結果。

膠體金快速檢測法操作簡便,且靈敏度高,檢測人員只需稍加培訓即可進行檢測操作,適于基層人員開展蔬菜中農藥殘留的快速檢測。 但該方法目前能檢測的農藥品種不多,與實際生產(chǎn)的需求還有一定差距,市場上經(jīng)權威機構驗證的產(chǎn)品也很少,需要進一步提高該類產(chǎn)品在生產(chǎn)和基層一線的適用性以滿足當前我國蔬菜生存和監(jiān)管的實際需求,實現(xiàn)源頭監(jiān)管的理念。