王小杰,陳其欣,張 華,張 淼,王 星,談重芳?

(1 鄭州大學(xué),河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州450052;2 鄭州大學(xué),鄭州450052)

化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要作用。 化肥的普遍應(yīng)用使我國(guó)糧食產(chǎn)量迅速增加,但其危害也較為明顯,化肥殘留、土地資源破壞、土壤污染等因素造成農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降,甚至危害人們的健康[1]。 隨著生活水平的不斷提高,人們?cè)絹?lái)越追求綠色、健康、無(wú)污染的食物,所以微生物肥料這一健康、高效、成本低的肥料應(yīng)運(yùn)而生。

從廣義上來(lái)講,微生物肥料是指一類具有活的微生物,并在肥料使用過(guò)程中使植物獲得特定的效能,增加植物產(chǎn)量以及提高質(zhì)量的生物制劑[1]。 微生物肥料不僅具有資源豐富、種類及功能多的特點(diǎn),而且也是一種無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)污染的可再利用的低成本肥料。 微生物肥料可在增加土壤肥力、增強(qiáng)作物抗性、改善土壤結(jié)構(gòu)、提高作物產(chǎn)量的同時(shí),減少化肥的用量,改善農(nóng)作物品質(zhì)[2]。

雖然國(guó)內(nèi)對(duì)微生物肥料已有諸多研究,但只有少量研究將乳酸菌作為微生物肥。 乳酸菌是指一類可發(fā)酵碳水化合物并且能產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱[3],分布十分廣泛,用途涉及食品、工業(yè)、飼料和生物醫(yī)藥等方面。 本試驗(yàn)以乳酸菌作為微生物肥料,研究不同種類和不同濃度的乳酸菌對(duì)小麥幼苗生理生化特性的影響,旨在為乳酸菌作為微生物肥料在促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng)方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為‘矮抗58’;供試乳酸菌品種為保存在河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的3 株乳酸菌,分別為副植物乳桿菌Lactobacillus paraplantarum(QZ227)、植物乳桿菌L.plantarum(N-1)和干酪乳桿菌L.casei(F19-30),均為革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的桿狀乳酸菌,分別分離自小麥、土壤和裸鯉腸道。

1.2 試驗(yàn)方法

從-80 ℃超低溫冰箱中取出供試的3 株乳酸菌,在MRS 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)傳代2 次,用接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)接到液體MRS 培養(yǎng)基中,放入恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)24 h,然后按10%的接種量在液體MRS 培養(yǎng)基中30 ℃繼續(xù)傳代培養(yǎng)2 次,備用。

1.2.1 種子預(yù)處理和乳酸菌接種

將小麥種子用75%(體積分?jǐn)?shù))的酒精浸泡10 s,進(jìn)行表面消毒,然后用無(wú)菌水沖洗2 次,以洗去殘留酒精。 將活化好的乳酸菌接種在MRS 液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)好的乳酸菌液體在4 ℃條件下以10 000g離心20 min,以從培養(yǎng)液里分離出乳酸菌沉淀,用無(wú)菌水清洗2 次,以除去MRS 培養(yǎng)液殘留。將離心好的乳酸菌用無(wú)菌水重懸,使乳酸菌濃度為109cfu∕mL、108cfu∕mL、107cfu∕mL 3 個(gè)梯度。 將消毒后的小麥種子浸泡在乳酸菌菌懸液中6 h 后播種,菌懸液按菌株不同及菌液濃度不同分為9 組,每組3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)50 粒小麥種子,以同樣條件用無(wú)菌水浸泡小麥種子6 h 作為對(duì)照,對(duì)照為3 個(gè)重復(fù),分別對(duì)應(yīng)3 個(gè)菌液濃度。 將處理后的小麥種子放置于25 ℃溫室中培養(yǎng)15 d,期間按需要澆水。

1.2.2 小麥幼苗指標(biāo)測(cè)定

收苗前測(cè)定小麥種子的發(fā)芽率,并用SPAD-502Plus 葉綠素測(cè)定儀測(cè)定小麥幼苗葉片的葉綠素含量。小麥幼苗在溫室培養(yǎng)15 d 后測(cè)定其葉鮮質(zhì)量及苗長(zhǎng)。

抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)]活性的測(cè)定采用李合生[4]的方法。 可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[4]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)小麥幼苗生物量和生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對(duì)小麥種子發(fā)芽率和幼苗生物量的影響

如表1 所示,當(dāng)菌液濃度為109cfu∕mL 時(shí),接種不同菌株的小麥種子發(fā)芽率均顯著高于對(duì)照;當(dāng)菌液濃度為108cfu∕mL 時(shí),接種不同菌株的小麥種子發(fā)芽率與對(duì)照無(wú)顯著差異;當(dāng)菌液濃度為107cfu∕mL時(shí),接種菌株N-1 的小麥種子發(fā)芽率最高,比對(duì)照提高了9.6%。 相同菌株不同濃度之間比較,除菌株N-1 接種濃度為108cfu∕mL 時(shí)小麥種子發(fā)芽率顯著低于其他接種濃度外,接種其他相同菌株不同濃度小麥種子發(fā)芽率均無(wú)顯著差異。

如表1 所示,與對(duì)照相比,接種3 種不同濃度的N-1 菌株可使小麥幼苗葉鮮質(zhì)量分別增加15.36%、9.98%和14.20%,其中109cfu∕mL 和107cfu∕mL 處理差異顯著;而接種其他2 種菌株無(wú)顯著差異,表明接種菌株N-1 能顯著增加小麥幼苗葉鮮質(zhì)量。 相同菌株不同濃度之間比較,除菌株QZ227 在108cfu∕mL時(shí)小麥幼苗葉鮮質(zhì)量顯著降低外,其他菌株處理的小麥幼苗葉鮮質(zhì)量均無(wú)顯著差異。

如表1 所示,與對(duì)照相比,不同菌株在接種濃度為109cfu∕mL 時(shí)均能顯著增加小麥幼苗苗長(zhǎng),接種濃度為108cfu∕mL 時(shí)菌株N-1 和F19-30 能顯著增加苗長(zhǎng),接種濃度為107cfu∕mL 時(shí)只有菌株N-1 能顯著增加苗長(zhǎng),表明接種不同濃度的菌株N-1 均能顯著增加小麥幼苗苗長(zhǎng);相同菌株不同濃度之間比較,小麥幼苗苗長(zhǎng)均無(wú)顯著差異。

表1 乳酸菌對(duì)小麥種子發(fā)芽率和幼苗生物量的影響Table 1 Effects of lactic acid bacteria on germination rate and seedling biomass of wheat

圖1 乳酸菌對(duì)小麥幼苗葉綠素SPAD 值的影響Fig.1 Effects of lactic acid bacteria on SPAD value of chlorophyll in wheat seedlings

2.2 乳酸菌對(duì)小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 乳酸菌對(duì)小麥幼苗葉綠素SPAD 值的影響

由圖1 可以看出,與對(duì)照相比,不同菌株在接種3 種不同濃度時(shí)均能顯著提高小麥幼苗葉綠素SPAD 值。 菌株N-1、QZ227 和F19-30 濃度為109cfu∕mL 時(shí),葉綠素SPAD 值分別提高7.9%、5.1%、7.8%;濃度為108cfu∕mL時(shí),分別提高7.9%、4.7%、6.4%;濃度為107cfu∕mL時(shí),分別提高5.8%、10.5%、5.3%。 相同菌株不同濃度之間相比較,除菌株F19-30 在濃度為107cfu∕mL 時(shí)葉綠素SPAD 值顯著降低外,其他菌株處理的小麥幼苗SPAD 值均無(wú)顯著差異。

2.2.2 乳酸菌對(duì)小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

2.2.2.1 POD 活性

如圖2 所示,與對(duì)照相比,不同菌株接種濃度為107cfu∕mL時(shí)均能顯著提高小麥幼苗的POD 活性,POD 活性分別提高了43.5%、32.0%和42.8%;濃度為108cfu∕mL時(shí)其POD 活性無(wú)顯著差異;濃度為109cfu∕mL 時(shí)只有菌株N-1 能顯著提高其POD 活性。 相同菌株不同濃度之間比較,菌株F19-30 濃度為107cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗POD 活性顯著高于其他濃度;接種3 種不同濃度的菌株N-1 和QZ227 小麥幼苗POD 活性無(wú)顯著差異。

2.2.2.2 SOD 活性

如圖3 所示,與對(duì)照相比,當(dāng)菌株濃度為109cfu∕mL 時(shí),接種菌株F19-30 的小麥幼苗SOD 活性顯著降低,其他菌株無(wú)顯著差異;接種其他濃度時(shí)不同菌株之間SOD 活性均無(wú)顯著差異。 相同菌株不同濃度之間相比較,小麥幼苗SOD 活性無(wú)顯著差異。

圖2 乳酸菌對(duì)小麥幼苗POD 活性的影響Fig.2 Effects of lactic acid bacteria on POD activity of wheat seedlings

圖3 乳酸菌對(duì)小麥幼苗SOD 活性的影響Fig.3 Effects of lactic acid bacteria on SOD activity of wheat seedlings

2.2.2.3 CAT 活性

由圖4 可以看出,菌株N-1 在接種濃度為109cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗CAT 活性最高且顯著高于對(duì)照,其他不同菌株相同濃度處理與對(duì)照無(wú)顯著差異。 接種菌株N-1 的小麥幼苗CAT 活性在3 個(gè)不同濃度之間差異顯著,其中在濃度為109cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗CAT 活性最高,濃度為107cfu∕mL 時(shí)其CAT 活性最低。接種菌株QZ227 和F19-30 不同濃度之間差異不顯著。

2.2.3 乳酸菌對(duì)小麥幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖5 可以看出,與對(duì)照相比,接種菌株N-1 在濃度為109cfu∕mL 和108cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗可溶性蛋白含量均顯著增加,且在濃度為109cfu∕mL 時(shí)可溶性蛋白含量最高,當(dāng)接種濃度為107cfu∕mL 時(shí)無(wú)顯著變化;接種菌株QZ227 濃度為109cfu∕mL 時(shí),小麥幼苗可溶性蛋白含量顯著增加;接種3 種不同濃度的菌株F19-30 時(shí),小麥幼苗可溶性蛋白含量差異不顯著。 相同菌株不同濃度之間比較,小麥幼苗可溶性蛋白含量均無(wú)顯著差異。

圖4 乳酸菌對(duì)小麥幼苗CAT 活性的影響Fig.4 Effects of lactic acid bacteria on CAT activity of wheat seedlings

圖5 乳酸菌對(duì)小麥幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effects of lactic acid bacteria on soluble protein content of wheat seedlings

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn),與其他乳酸菌菌株相比,植物乳桿菌N-1 能更好地促進(jìn)小麥幼苗的生長(zhǎng),這與Kang等[5]和Limanska 等[6]研究結(jié)果一致。 在小麥幼苗生物量方面,各菌株在接種濃度為109cfu∕mL 時(shí),小麥種子發(fā)芽率顯著高于對(duì)照;且接種菌株N-1 濃度為107cfu∕mL 時(shí)發(fā)芽率最高,與對(duì)照相比提高了9.6%。不同菌株接種濃度為107cfu∕mL 和菌株N-1 接種濃度為109cfu∕mL 時(shí),小麥幼苗葉鮮質(zhì)量均顯著高于對(duì)照,且接種菌株N-1 濃度為109cfu∕mL 和107cfu∕mL 時(shí)葉鮮質(zhì)量最高,分別比對(duì)照增加了15.36%和14.20%。 與對(duì)照相比,接種3 種不同濃度菌株N-1 均顯著增加了小麥幼苗苗長(zhǎng),分別增加了7.1%、8.5%和7.4%。 就小麥幼苗生物量而言,接種菌株N-1 對(duì)小麥幼苗促進(jìn)效果最好。

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ),是葉片的主要光合色素,葉綠素含量的高低是反應(yīng)植物葉片光合能力及植株健康狀態(tài)的主要指標(biāo)[7]。 SPAD-502Plus 葉綠素測(cè)定儀可在田間無(wú)損狀況下快速測(cè)定植物葉片單位面積當(dāng)前葉綠素的相對(duì)含量[8],即SPAD 值。 本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,各菌株接種3種不同濃度菌懸液均能顯著提高小麥幼苗葉綠素SPAD 值,表明接種乳酸菌有利于小麥幼苗葉綠素含量的增加。

植物體內(nèi)具有抗氧化系統(tǒng),如抗氧化酶可有效清除植物組織中的活性氧,對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用[9]。 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)是抗氧化酶系統(tǒng)中控制植物體內(nèi)活性氧積累最主要的酶[9]。 POD 是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的一種保護(hù)酶,能有效催化過(guò)氧化氫分解成水,從而有效阻止過(guò)氧化氫在植物體內(nèi)累積,排除其對(duì)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的潛在傷害[10]。 SOD 是生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的清除劑,能有效防止它們對(duì)生物體產(chǎn)生損害,參與植物體對(duì)脅迫所做出的各種生理生化反應(yīng),是植物體內(nèi)一種很重要的抗氧化酶類[11]。 CAT 與過(guò)氧化氫具有較高的親和力,主要清除線粒體電子傳遞、脂肪酸氧化過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫,其含量變化是植物體內(nèi)過(guò)氧化氫變化的標(biāo)志性反應(yīng)[10]。 CAT、SOD 和POD 組成植物體內(nèi)活性氧清除劑系統(tǒng),有效清除植物體內(nèi)的自由基和過(guò)氧化物[12]。 在小麥幼苗抗氧化酶活性方面,接種各菌株濃度為107cfu∕mL 和接種菌株N-1 濃度為109cfu∕mL 時(shí)均能提高小麥幼苗POD 活性,其中接種菌株N-1、QZ227 和F19-30 濃度為107cfu∕mL 時(shí)POD 活性分別比對(duì)照提高了43.5%、32.0%和42.8%;菌株F19-30 接種濃度為107cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗的SOD 活性最強(qiáng),顯著高于對(duì)照;菌株N-1 在接種濃度為109cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗CAT 活性最強(qiáng),顯著高于對(duì)照。

植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多是參與各種代謝的酶類,約有50%的可溶性蛋白是光合作用的關(guān)鍵酶,其含量是了解植物體內(nèi)總體代謝水平和光合能力高低的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。 從本研究可知,菌株N-1 在接種濃度為109cfu∕mL 時(shí)小麥幼苗可溶性蛋白含量最高,且顯著高于對(duì)照,濃度為107cfu∕mL 時(shí)也能顯著提高小麥幼苗的可溶性蛋白含量。

綜上,與對(duì)照相比,接種植物乳桿菌N-1 濃度為109cfu∕mL 時(shí)除不能提高小麥幼苗SOD 活性外,對(duì)小麥幼苗其他生物量及生理生化指標(biāo)均有顯著的促進(jìn)作用,表明植物乳桿菌N-1 具有作為微生物肥料的潛能;而接種菌株QZ227 和F19-30 對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)作用較小。 相同菌株不同濃度之間對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用差異不顯著,表明乳酸菌濃度可能不是促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。 本試驗(yàn)后續(xù)將對(duì)小麥幼苗后期的長(zhǎng)勢(shì)以及乳酸菌的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究,以期為今后提高大田小麥產(chǎn)量提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。