徐建麗， 袁海龍， 王洪波， 陳 剛， 楊蕊雪， 古力巴旦木·艾則孜，瑪麗婭·木哈什， 曲建華， 龐楠楠， 江 明

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液病中心，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所，新疆 烏魯木齊 830054

異基因造血干細胞移植選擇單倍體相合的供者進行單倍體相合造血干細胞移植，以提高白血病治愈率。但治療后移植物抗宿主病(graft versus host disease，aGVHD)發(fā)生率顯著增加，多通過兔抗人胸腺免疫球蛋白(anti-thymocyte，ATG)克服人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)不合，同時消耗體內(nèi)T細胞來抑制aGVHD的進展[1]。重組人粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)動員后，外周血干細胞移植中aGVHD發(fā)生率降低，該機制主要為G-CSF可從骨髓動員更多的髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)到達外周而達到免疫耐受[2-3]。本研究設(shè)計并逐步完善了親緣間HLA單倍體相合非體外去T細胞高劑量外周血造血干細胞移植(related HLA-haploidentical non T cell-depleted in vitro high dose peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation,RH-PBSCT)模式，即輸注經(jīng)G-CSF動員高劑量的非體外去T細胞外周血單個核細胞，分析治療后細胞免疫功能的變化及急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)的發(fā)生率，以期為異基因造血干細胞移植提供更多的可能思路。現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2012年1月至2018年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行RH-PBSCT治療的98例白血病患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡<50歲；HLA配型無全相合供者(中華骨髓庫無關(guān)供者和臍帶血庫尋找相匹配的臍帶血均無或病情不能等待者)，選擇親緣間的單倍體供者；移植前無活動性感染者；移植前無明顯臟器損傷功能障礙者；預(yù)處理前供者體內(nèi)免疫相關(guān)的各項指標(biāo)(Th1及Th2型細胞因子，CD4+CD25+Treg細胞)均正常?；颊吣挲g4～50歲，其中，年齡<40歲63例，年齡≥40歲35例；男性40例，女性58例；急性髓系白血病50例、急性淋巴細胞白血病45例，骨髓增生異常綜合征3例；標(biāo)危45例，高危53例?？煞治鯩DSCs標(biāo)本親緣單倍體相合健康供者30例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)?；颊呔橥?。

1.2 研究方法 供者于輸注干細胞前5 d開始應(yīng)用G-CSF 7～10 μg/kg/d，G-CSF使用后5、6 d開始使用血細胞分離機分離外周血干細胞，故于G-CSF動員前及動員后5、6 d采集供者外周血，并于動員后5、6 d收集外周血造血干細胞。若患者移植后未發(fā)生aGVHD，在移植后30、60、90 d時檢測MDSCs細胞的相對數(shù)量；若患者在移植后發(fā)生aGVHD，在發(fā)生時立即檢測，治療過程中每周動態(tài)監(jiān)測至aGVHD完全控制，aGVHD完全控制或明顯緩解后再檢測1次。aGVHD的診斷和分級參考西雅圖診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.3 觀察指標(biāo) 流式細胞術(shù)檢測G-CSF動員前后，移植后患者30、60、90 d的MDSCs細胞的相對數(shù)量變化。酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測移植后患者30、60、90 d的Th1及Th2型細胞因子[轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β， TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)]，以及CD4+CD25+Treg細胞的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 健康供者 G-CSF動員前、后MDSCs含量比較供者動員后MDSCs含量為(3.14%±1.01%)，高于動員前的(1.66%±0.78%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.335,P<0.05)。見圖1。

2.2 aGVHD發(fā)生高危因素分析

2.2.1 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組MDSCs含量比較 G-CSF動員后發(fā)生aGVHD55例(56.1%)，中位發(fā)生時間為42 d(7～88 d)。根據(jù)aGVHD的發(fā)生情況將患者分為aGVHD發(fā)生組(n=55)與aGVHD未發(fā)生組(n=43)。移植后30、60、90 d，aGVHD發(fā)生組MDSCs含量均低于aGVHD未發(fā)生組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 MDSCs表達的流式圖

表1 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組MDSCs含量比較

2.2.2 aGVHD發(fā)生組病情控制前后MDSCs含量比較 移植后30、60、90 d，aGVHD發(fā)生組病情控制后的MDSCs含量均高于控制前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2.3 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組Th1及Th2型細胞因子、CD4+CD25+Treg細胞含量比較 移植后30、60、90 d，aGVHD發(fā)生組IL-10及CD4+CD25+Treg細胞含量均低于aGVHD未發(fā)生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組TGF-β、TNF-α、IL-6比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 aGVHD發(fā)生組病情控制前后MDSCs含量比較

2.2.4 aGVHD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示，MDSCs、IL-10、CD4+CD25+Treg細胞含量均為aGVHD發(fā)生的獨立影響因素(P<0.05)。見表4。

3 討論

既往有研究報道，MDSCs表達與B細胞淋巴瘤[5]和血液病患者[6]的不良預(yù)后相關(guān)；但也有研究報道，MDSCs在感染性疾病[7]、自身免疫性疾病[8]中具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。上述研究均表明，MDSCs可顯著抑制T細胞增殖。近年來，MDSCs誘導(dǎo)免疫耐受的機制在異基因移植中誘導(dǎo)移植免疫耐受、提高臨床治療效果方面提供了新思路。

本研究中，30例健康供者G-CSF動員后第5天外周血及外周血干細胞采集物中MDSCs含量高于動員前；同時，MDSCs含量在aGVHD患者中呈低表達，提示MDSCs的表達在aGVHD發(fā)生中具有重要價值；而G-CSF的刺激可提高MDSCs表達，可能對疾病的防治有一定價值。MDSCs降低aGVHD發(fā)生率的機制與抑制T細胞免疫功能有關(guān)，而該通路可通過多個途徑實現(xiàn)[9]。T前體細胞在抗原的刺激下，可選擇性分化為Th1、Th2、Th17等細胞，早期研究證實了Th1類細胞因子γ干擾素、TNF-α等促進aGVHD的發(fā)生，而Th2類細胞因子能抑制γ干擾素的分泌而減輕aGVHD[10]。Thl/Th2細胞比例與單倍體組高aGVHD發(fā)病有關(guān)，可抑制免疫反應(yīng)，其主要通過分泌IL-10和TGF-β來實現(xiàn)，IL-10能夠下調(diào)效應(yīng)T淋巴細胞的增殖和分化，是對aGVHD的負性調(diào)節(jié)[11]。若對宿主組織器官予以保護，可減輕宿主組織器官炎性細胞因子的過度分泌，使移植后細胞免疫類細胞因子的產(chǎn)生趨于平衡，從而改善aGVHD。本研究結(jié)果還顯示，移植后MDSCs含量變化與aGVHD的發(fā)生與緩解同步發(fā)生，進一步證實MDSCs直接參與了aGVHD的發(fā)生發(fā)展。

Luo等[12]采用骨髓和/或外周血移植，aGVHD累積發(fā)生率為57.4%。本研究采用RH-PBSCT模式，輸注經(jīng)G-CSF動員高劑量的非體外去T細胞外周血單個核細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aGVHD累積發(fā)生率為56.1%，低于Luo等[12]報道結(jié)果，提示單倍體組預(yù)處理方案中加用ATG，具有較持久的T細胞清除和加快移植物的嵌合作用。本研究移植模式主要分為4個方面：一是G-CSF動員供者非體外去T細胞高劑量單個核細胞回輸；二是清髓性預(yù)處理方案，2～3個位點不合者采用TBI/CY或ABU/CY+ATG，1個位點不合者不加ATG；三是aGVHD預(yù)防方案，2～3個位點不合者采用CsA/Tac+短程MTX+MMF+抗CD25單克隆抗體+GLU，1個位點不合者則不加抗CD25單克隆抗體；四是預(yù)防感染措施加強，包括細菌、真菌和病毒等感染防控力度均加強。G-CSF可通過下調(diào)CD28/B7分子表達和增加DC2 APC表達，阻斷正性共刺激分子后，促進Th1細胞能更多地分化為Th2，增加的Th2細胞及其分泌的因子與誘導(dǎo)免疫耐受和G-CSF動員出較多的MDSCs有關(guān)。本研究結(jié)果表明，MDSCs、IL-10、CD4+CD25+Treg細胞含量為aGVHD發(fā)生的獨立影響因素(P<0.05)。G-CSF動員干細胞可促使Th1向Th2轉(zhuǎn)化，從而減少aGVHD的發(fā)生，并使相關(guān)免疫細胞因子呈低反應(yīng)性。有研究報道，單倍體組部分患者輸注了高劑量CD34+細胞，其中部分細胞能特異地殺滅識別其表面抗原的受體前體細胞毒T細胞，從而誘導(dǎo)免疫耐受，促進植入，減少aGVHD的發(fā)生[13]。

表3 aGVHD發(fā)生與未發(fā)生組Th1及Th2型細胞因子、CD4+CD25+Treg細胞含量比較濃度/pg·ml-1)

表4 aGVHD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

綜上所述，RH-PBSCT后血清免疫指標(biāo)MDSCs IL-10、CD4+CD25+Treg細胞含量的降低對早期診斷aGVHD有一定的輔助價值。