李佳 楊曉丹 劉永葉

【摘要】 目的：研究消癌解毒方提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期蛋白、PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)作用。方法：培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞并分為用不含血清及藥物的DMEM處理的對(duì)照組、用含有不同濃度（0.375、0.75、1.5 mg/mL）消癌解毒方提取物DMEM處理的提取物組，測(cè)定細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋白、PI3K/AKT通路分子的表達(dá)水平。結(jié)果：不同濃度提取物組細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于對(duì)照組，且隨著濃度的增加、時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高;不同濃度提取物組G0/G1期比例及p53、p21的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，G2/M期比例及CyclinD1、CyclinB1、PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，且隨著濃度的增加，G0/G1期比例及p53、p21的mRNA表達(dá)水平明顯升高，G2/M期比例及CyclinD1、CyclinB1、PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平均明顯降低。結(jié)論：消癌解毒方提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期具有抑制作用，拮抗PI3K/AKT通路是潛在的分子機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 消癌解毒方 增殖 細(xì)胞周期 PI3K/AKT

[Abstract] Objective： To study the regulatory effects of extracts of Xiaoai Jiedu Decoration on proliferation activity， cell cycle protein and PI3K/AKT pathway of breast cancer cells. Method： Breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured and divided into the control group treated with DMEM without serum and drugs and the extract group treated with DMEM containing different concentrations （0.375， 0.75， 1.5 mg/mL） of Xiaoai Jiedu Decoration. Then cell proliferation activity， cell cycle and the expression of cell cycle protein， PI3K-AKT pathway molecule were determined. Result： The inhibition rate of cell proliferation in different concentration extract group were significantly higher than that in the control group， and the inhibition rate of cell proliferation significantly increased with the increase of concentration and time. The ratio of G0/G1 phase and the mRNA expression levels of p53， p21 in different concentration extract group were significantly higher than those in the control group， and the ratio of G2/M phase and he mRNA expression levels of CyclinD1， CyclinB1， PI3K， AKT and mTOR were significantly lower than those of the control group. The ratio of G0/G1 phase and the mRNA expression levels of p53， p21 significantly increased with the increase of concentration and he ratio of G2/M phase and he mRNA expression levels of CyclinD1， CyclinB1， PI3K， AKT and mTOR significantly decreased with the increase of concentration. Conclusion： The extract of Xiaoai Jiedu Decoration has inhibitory effect on proliferation and cell cycle of breast cancer cells， antagonism of PI3K/AKT pathway is a potential molecular mechanism.

[Key words] Breast cancer Xiaoai Jiedu Decoration Proliferation Cell cycle PI3K/AKT

First-authors address： General Hospital of the Northern Theater of the Chinese Peoples Liberation Army， Shenyang 110016， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.06.006

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，近年來的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，臨床上治療乳腺癌的常用方法包括手術(shù)切除、放化療、內(nèi)分泌治療等，在手術(shù)切除后進(jìn)行放化療、內(nèi)分泌治療能有效提高患者生存率、延長生存時(shí)間[1-2]。盡管如此，乳腺癌患者在放化療、內(nèi)分泌治療過程中所出現(xiàn)的耐藥、毒副反應(yīng)等會(huì)影響療效，因而研發(fā)更加高效低毒的抗腫瘤藥物是乳腺癌研究的熱點(diǎn)。消癌解毒方是重要抗藥方劑，由白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、莪術(shù)、太子參和麥冬組成，其中藥功效是驅(qū)邪扶正，相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究則證實(shí)消癌解毒方中的多種藥材能在體外發(fā)揮抗結(jié)腸癌、抗肝癌的作用[3-4]，但關(guān)于消癌解毒方的抗卵巢癌作用尚不明確。PI3K/AKT通路活化所介導(dǎo)的細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、細(xì)胞周期加速是卵巢癌發(fā)病的重要分子機(jī)制之一。為了明確消癌解毒方用于卵巢癌治療的價(jià)值，本研究具體分析了消癌解毒方提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期蛋白、PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 MDA-MB-231細(xì)胞購自ATCC公司，DMEM、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自Gibco公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，超純RNA提取試劑盒、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1 消癌解毒方提取物的制備 白花蛇舌草154 g，莪術(shù)77 g，半枝蓮39 g，山慈菇77 g，太子參77 g，麥冬77 g，加10倍量水煎煮2 h后收集濾液，再加入8倍量水煎煮1.5 h后收集濾液，合并兩次濾液并濃縮為生藥含量為2 g/mL的藥液，加入乙醇至乙醇含量為70%，靜置過夜后抽濾得到濾液，濃縮、低溫干燥后得到浸膏粉，取0.3 g浸膏粉溶解在1 mL DMSO中備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 MDA-MB-231細(xì)胞用含有10%FBS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量大85%融合后用胰蛋白酶消化，將消化后得到細(xì)胞懸液的密度調(diào)節(jié)至2×108/L，接種在培養(yǎng)板中并分為對(duì)照組和不同濃度消癌解毒方提取物處理的提取物組，對(duì)照組用不含血清及藥物的DMEM處理，提取物組用含有0.375、0.75、1.5 mg/mL消癌解毒方提取物的DMEM處理。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞接種在96孔板中，每孔100 μL，不同條件處理24、48、72 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力，向每孔內(nèi)加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄培養(yǎng)基并向每孔加入DMSO 150 μL，震蕩15 min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光值（OD），按照公式（OD對(duì)照組-OD提取物組）/OD對(duì)照組計(jì)算增殖抑制率。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞接種在12孔板中，每孔500 μL，不同條件處理72 h后，采用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后加入70%乙醇0.5 mL、4 ℃固定過夜，第2天用磷酸鹽緩沖液洗去乙醇后加入400 μL PI染色液后混勻，避光染色30 min后在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞周期。

1.2.5 基因表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞接種在6孔板中，每孔1.5 mL，不同條件處理72 h后，采用超純RNA提取試劑盒提細(xì)胞中的RNA，采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用UltraSYBR Mixture試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算CyclinD1、CyclinB1、p53、p21、PI3K、AKT、mTOR的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度消癌解毒方提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用 與對(duì)照組比較，不同濃度消癌解毒方提取物組均可明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，隨著時(shí)間延長、濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性，見表1。

2.2 不同濃度消癌解毒方提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用 與對(duì)照組比較，不同濃度消癌解毒方提取物組細(xì)胞G0/G1期比例顯著升高，G2/M期比例明顯降低，S期比例無顯著變化，G0/G1期、G2/M期的變化具有明顯的濃度依賴性，見表2。

2.3 不同濃度消癌解毒方提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 與對(duì)照組比較，不同濃度消癌解毒方提取物組中CyclinD1、CyclinB1的mRNA表達(dá)水平顯著降低，p53、p21的mRNA表達(dá)水平顯著增加，具有明顯的濃度依賴性，見表3和圖1。

2.4 不同濃度消癌解毒方提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K/AKT通路分子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 與對(duì)照組比較，不同濃度消癌解毒方提取物組PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平顯著降低，具有明顯的濃度依賴性，見表4和圖2。

3 討論

我國乳腺癌的發(fā)病率逐年升高且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，同時(shí)該病也是造成我國45歲以下女性死亡的主要病因之一[5-6]。雖然近年來化療藥物、內(nèi)分泌治療藥物、靶向治療藥物在乳腺癌治療中的應(yīng)用不斷推廣，患者的預(yù)后得到了較大改善，但仍有部分患者會(huì)在治療過程中出現(xiàn)耐藥及毒副反應(yīng)，療效仍有較大提升空間。中藥材的抗腫瘤作用日益受到關(guān)注，消癌解毒方是具有廣泛抗癌作用的中藥方劑，該方劑中的白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、莪術(shù)、太子參和麥冬已被多項(xiàng)離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抑癌作用，能使乳腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、血管新生等惡性生物學(xué)行為受到抑制[7-11]，但關(guān)于該方劑用于乳腺癌治療的價(jià)值仍缺乏研究支持。

本研究以離體培養(yǎng)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，制備消癌解毒方提取物后在離體水平分析了消癌解毒方的抗乳腺癌作用。在乳腺癌的病理進(jìn)程中，病灶內(nèi)癌細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、細(xì)胞周期加速是造成腫瘤生長最關(guān)鍵的生物學(xué)行為，通過對(duì)細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞周期的分析分別發(fā)現(xiàn)：不同濃度消癌解毒方提取物能夠增加細(xì)胞增殖的抑制率且濃度越大、時(shí)間越長，細(xì)胞增殖抑制率的增加越明顯，提示消癌解毒方對(duì)乳腺癌的增殖具有抑制作用;不同濃度的消癌解毒方提取物能夠增加細(xì)胞周期G0/G1期比例、降低G2/M期比例且濃度越大，G0/G1期比例的增加、G2/M期比例的降低越明顯，提示消癌解毒方對(duì)乳腺癌的細(xì)胞周期具有阻礙作用，能夠使細(xì)胞周期大量停滯于G0/G1期、無法順利進(jìn)入G2/M期并完成有絲分裂。結(jié)合細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的分析結(jié)果表明，消癌解毒方能夠在離體水平發(fā)揮抗乳腺癌作用。

乳腺癌細(xì)胞周期的進(jìn)程受到多種細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控，而細(xì)胞周期蛋白表達(dá)又受到上游PI3K/AKT通路的影響。CyclinB1、CyclinD1是兩種重要的細(xì)胞周期蛋白，與各自的CDK結(jié)合形成復(fù)合體后能夠加速細(xì)胞周期通過G0/G1期、S期、G2/M期的檢查點(diǎn)，迅速進(jìn)入有絲分裂階段[12-14];上游PI3K/AKT通路發(fā)生活化后能夠通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)使mTOR的表達(dá)增加，mTOR進(jìn)入細(xì)胞核后能夠啟動(dòng)CyclinB1、CyclinD1的表達(dá)并參與細(xì)胞周期的調(diào)控[15-17]。p53和p21是兩種細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控基因，能夠阻礙細(xì)胞周期蛋白與其激酶的結(jié)合及活化，進(jìn)而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程[18-20]。本研究對(duì)上述細(xì)胞周期蛋白及PI3K/AKT通路的分析發(fā)現(xiàn)：不同濃度消癌解毒方提取物能夠降低細(xì)胞中CyclinD1、CyclinB1、PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)水平，增加p53、p21的mRNA表達(dá)水平且濃度越大，CyclinD1、CyclinB1、PI3K、AKT、mTOR表達(dá)的降低及p53、p21表達(dá)的增加越明顯。這一結(jié)果表明消癌解毒方對(duì)乳腺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白及PI3K/AKT均具有負(fù)性調(diào)控作用。

綜上所述，消癌解毒方提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期具有抑制作用，拮抗PI3K/AKT通路是消癌解毒方發(fā)揮抗乳腺癌作用的潛在分子機(jī)制。

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（收稿日期：2020-12-03） （本文編輯：程旭然）