王瑩威,姜 暉,王 博,王 靜

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管狹窄或者堵塞引起的心肌細(xì)胞缺血損傷的一種心臟病，中醫(yī)辨證多屬氣虛血瘀型，在各型冠心病中所占比例>10%[1]。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼的微小RNA，可參與人體多種代謝活動，miR-126是miRNA中含量較多的一類微小RNA，其具有抗動脈粥樣硬化作用。冠心病患者miR-126表達(dá)水平降低[2]，miR-126水平增加可以促進(jìn)受損心肌的修復(fù)[3]。Rho激酶是一種GTP結(jié)合蛋白重要效應(yīng)分子，可以通過Rho/Rho激酶信號通路參與細(xì)胞的多種生理功能及細(xì)胞過程，Rho/Rho激酶信號通路與多種心血管疾病有密切關(guān)系[4]。近年來，中藥在冠心病的治療中發(fā)揮了重要作用，前期研究證實益氣降濁湯治療心血管疾病有較好療效[5-7]。本研究通過建立冠心病氣虛血瘀型大鼠模型，觀察了其對miR-126及Rho激酶的影響，旨在進(jìn)一步明確益氣降濁湯的作用機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF清潔級雄性Wistar大鼠48只,體重(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號：SCXK(黑)2018-003。

1.2試劑及儀器 益氣降濁湯由黃芪、莪術(shù)、苦參、川芎、當(dāng)歸、防風(fēng)、丹參、桃仁、土茯苓、萆薢、茯苓、澤瀉、牡丹皮、甘草組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備。miR-126試劑盒購自上?？泼羯镉邢薰?DZT-ST600729)；RNA提取試劑Trizol 購自美國Uibco公司(10296010)；Rho激酶引物購自上海江萊生物有限公司(0-020225)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)試劑盒購自武漢純度生物有限公司(批號分別為CD-1275-LIN， CD-1305-LIN， CD-0676-LIN)；注射用青霉素鈉購自北京凱瑞基生物有限公司(CY16250)； DAB顯色劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司(120390)。LH-PT動物實驗跑臺(南京卡爾文生物科技有限公司)；小動物專用吸入麻醉機(jī)(美國Matrx)；低溫高速離心機(jī)(美國BECKMANCOULTER公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3實驗方法 將48只雄性SPF清潔級大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、中藥組、單硝酸異山梨酯組，每組12只，大鼠隨意飲食飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，進(jìn)行4 d的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，每天1次，每次15～30 min。當(dāng)大鼠能夠以20 m/min的速度持續(xù)跑30 min后開始進(jìn)行建模。淘汰不能完成上述運動的大鼠，最終每組納入10只。在參考文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，通過2周跑臺運動建立大鼠疲勞運動模型后結(jié)扎冠脈：大鼠用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，氣管插管，連接小動物呼吸機(jī) (氧氣壓強(qiáng)0.1 MPa，氧氣流量300 mL/min)，胸骨左緣第3～4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳與動脈圓錐間用5-0手術(shù)線結(jié)扎，可見缺血區(qū)域變蒼白，心電圖示ST段弓背抬高，提示手術(shù)成功，然后擠壓出胸腔空氣并逐級縫合。縫合后注射青霉素160 IU/(kg·d)防止感染，連續(xù)3 d?？瞻捉M僅穿線不結(jié)扎。術(shù)后恢復(fù)4 d后開始進(jìn)行力竭運動(速度20 m/min，頻率1次/2 d)，造模時間為6周。造模完成后，中藥組給予中藥房煎煮好的益氣降濁湯18 g/(kg·d)灌胃，單硝酸異山梨酯組給予單硝酸異山梨酯片6 mg/(kg·d)灌胃，模型組及空白組給予等量的生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)4周。

1.4標(biāo)本采集及檢測

1.4.1血清指標(biāo) 灌胃結(jié)束后，麻醉各組大鼠腹腔采血，4 ℃下13 000 r/min離心10 min后，取上清液，采用全自動生化分析儀檢測血清CK、CK-MB、LDH水平，ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、CRP水平。

1.4.2心肌組織HE染色病理觀察 處死大鼠后取部分心肌組織，制備成石蠟切片后進(jìn)行HE染色，于電子顯微鏡下觀察心肌形態(tài)。

1.4.3心肌組織中miR-126及Rho激酶表達(dá)水平檢測 取大鼠部分心肌組織，用Trizol方法提取大鼠心肌組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，計算miR-126及Rho激酶表達(dá)水平。miR-126引物：F5’-GCTGGCATTATTACTTTTGGTACG-3’,R5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’；Rho激酶引物：F5’-TCGGAATGATTCTCACTAA-3’，R5’-GCTTCACATGTCTCACTGC-3’。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火,30 s，40個循環(huán)。U6作為miRNA的內(nèi)參，基因表達(dá)結(jié)果均以2-△△ct進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平比較 模型組大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；中藥組及單硝酸異山梨酯組大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平比較

2.2各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比較模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；中藥組及單硝酸異山梨酯組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

2.3各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn) 空白組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞間隙均勻；模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞壞死、排列紊亂，細(xì)胞核腫大變形，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，存在炎性浸潤；與模型組比較，中藥組及單硝酸異山梨酯組大鼠心肌細(xì)胞排列較整齊，炎性浸潤程度減輕。見圖1。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比較

2.4各組大鼠心肌組織中miR-126及Rho激酶表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中miR-126表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Rho激酶表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組及單硝酸異山梨酯組大鼠心肌組織中miR-126表達(dá)水平明顯升高(P均<0.05)，Rho激酶表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)。見表3。

3 討 論

冠心病在中醫(yī)上可歸于胸痹心痛病，病位主要在心，與肝脾腎有關(guān)。該病病機(jī)是血脈瘀阻，病性為本虛標(biāo)實，本虛指的是氣血陰陽虧虛，以氣虛為主，標(biāo)實主要指氣滯、血瘀、痰濁等，以血瘀為主，貫穿了冠心病發(fā)病的始終。20世紀(jì)70年代以來，以陳可冀院士為代表的科研團(tuán)隊提出了冠心病的基本病機(jī)是血脈瘀滯。隨著研究的深入，一些學(xué)者開始從microRNA角度探討冠心病的分型，為冠心病的分型提出了新思路[9],并提出了氣虛血瘀、痰濁血瘀等更多的中醫(yī)分型[10]。因此氣虛血瘀成為冠心病心肌損傷的一個重要證候。益氣降濁湯方中以黃芪為君，健脾益氣；當(dāng)歸養(yǎng)血和血，川芎活血行氣，莪術(shù)行氣破血；丹參、桃仁活血化瘀止痛，瘀血祛則脈道通利；土茯苓、茯苓、萆薢、澤瀉四者相須為用，淡滲利濕，使?jié)裥皬南露?；苦參、牡丹皮清熱涼血、養(yǎng)陰消瘀；甘草調(diào)和諸藥。諸藥相互配伍，既可健脾益氣，又可活血通脈?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有抗炎、抗氧化反應(yīng)的作用[11],川芎具有抗動脈硬化、促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)功能[12]，苦參具有抗氧化、抗纖維化、保護(hù)受損心肌細(xì)胞作用[13]。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×200)

表3 各組大鼠心肌組織中miR-126及Rho激酶表達(dá)水平比較

炎性反應(yīng)是公認(rèn)的冠心病病因之一，而miR-126可以抑制炎性因子，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，保護(hù)受損心肌[14]。王鳳等[15]發(fā)現(xiàn)miR-126水平上調(diào)能夠促進(jìn)受損心肌修復(fù)和心肌細(xì)胞生成，減輕心肌受損。趙經(jīng)緯等[16]證實Rho激酶抑制劑可以減輕炎性反應(yīng)，保護(hù)受損心肌。李琴等[17]研究證明ROCKs拮抗劑能夠抑制心肌缺血再灌注后的心肌細(xì)胞凋亡，減少炎性因子釋放，保護(hù)受損心肌。TNF-α、IL-6、CRP是常用的評價炎性反應(yīng)的指標(biāo)，與冠心病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[18]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP、CK、CK-MB、LDH水平及心肌組織中Rho激酶水平較正常組明顯升高，心肌組織中miR-126水平較正常組明顯降低，HE染色顯示大量心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、炎性浸潤，提示冠心病氣虛血瘀型大鼠存在明顯炎性反應(yīng)，心肌出現(xiàn)損傷。與模型組相比，中藥組及單硝酸異山梨酯組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP、CK、CK-MB、LDH水平及心肌組織中Rho激酶水平明顯降低，心肌組織中miR-126水平明顯升高，HE染色結(jié)果較模型組改善，提示益氣降濁湯可以抑制大鼠炎性反應(yīng)，減輕心肌損傷。

綜上所述，益氣降濁湯可能通過提高miR-126水平及降低Rho激酶水平來抑制炎性反應(yīng)，減輕大鼠心肌損傷，但是益氣降濁湯對冠心病氣虛血瘀型大鼠的心肌保護(hù)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。