許夢君，郭 曌，陸芝蘭

(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南 株洲 412000)

2型糖尿病多合并代謝綜合征1個或者多個組分的臨床表現(xiàn)，如血脂異常、高血壓、肥胖癥等，且隨著我國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和生活方式的改變，我國2型糖尿病的發(fā)生率逐年升高，目前已經(jīng)成為除惡性腫瘤、心腦血管疾病之外另一種嚴重威脅人群健康的慢性非傳染性疾病[1-2]。目前臨床上對于2型糖尿病多采用胰島素、降糖類藥物進行治療，但效果并不理想，且患者長期用藥有一定不良反應(yīng)[3]。中醫(yī)學(xué)將糖尿病歸屬為“消渴”范疇，大量文獻研究認為中藥干預(yù)有輔助降糖和穩(wěn)定控制血糖作用，且較安全[4]。消渴方是治療2型糖尿病的經(jīng)典方，本研究基于鈣調(diào)磷酸酶(CN)/活化T細胞因子(NFAT)信號通路，探討了該方治療2型糖尿病的可能作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 45只清潔級Wistar大鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供，動物許可證號：SYXK(京)2019-0011，鼠齡(4.3±0.3)個月，體重(219.0±11.2)g。大鼠均在無病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，室溫在(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲凈化水，飼養(yǎng)時間為1周。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，上海恒斐生物科技有限公司)；檸檬酸鈉緩沖液(北京凱瑞基生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)單克隆抗體(上海烜雅生物科技有限公司)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)單克隆抗體(上海江萊生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)單克隆抗體[西寶生物科技(上海)股份有限公司]；CN單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；NFATc1單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Bax單克隆抗體[西寶生物科技(上海)股份有限公司]；PDX-1單克隆抗體(上海烜雅生物科技有限公司)；Bcl-2單克隆抗體(上海烜雅生物科技有限公司)。

1.3藥物 消渴方組方：黨參、麥冬、茯苓各10 g，知母、丹皮、澤瀉各20 g，天花粉、生地、生山藥、丹參各30 g，水煎后藥液離心處理，取出雜質(zhì)，濃縮至1 g/mL的水煎液，高溫殺菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4分組、建模及干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常組、模型組、消渴方組各15只，模型組、消渴方組大鼠使用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)3周，分3次小劑量(35 mg/kg)腹腔注射STZ，正常組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液；1周后測定模型組、消渴方組大鼠空腹血糖(FPG)，若FPG≥11.1 mmol/L為建模成功[5]。 建模成功后，消渴方組大鼠給予消渴方7.5 g/kg灌胃，正常組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃15 d。

1.5樣本采集 干預(yù)結(jié)束后取尾部靜脈血3 mL,以離心半徑為5 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80 ℃保存，待用。隨機選取各組中3只大鼠處死，迅速取胰腺組織，行病理組織學(xué)觀察。選取各組中6只大鼠腹腔注射3.0% 的戊巴比妥80 mg/kg麻醉，迅速取胰腺組織，運用酶消化法采集大鼠胰島β細胞，加入PBS制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/mL，用于胰島β細胞生長活力、存活率、凋亡率檢測。處死每組中剩余6只大鼠，迅速取胰腺組織，用于氧化應(yīng)激損傷指標、CN/NFAT信號通路蛋白表達檢測。

1.6觀察指標及方法

1.6.1糖脂代謝、胰島功能指標檢測 采用Olympus AU2700全自動生化分析儀檢測各組大鼠FPG、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測空腹胰島素(FINS)水平，采用胰島β細胞功能指數(shù)(HBCI)、胰島β細胞分泌功能指數(shù)(FBCI)評價胰島功能，其中HBCI=20×FINS/(FPG-3.5)，F(xiàn)BCI=FINS/FPG。

1.6.2病理組織學(xué)觀察 取大鼠胰腺組織，使用4%多聚甲醛固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，之后行HE染色處理，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠胰腺組織病理變化。胰島β細胞胰島素分泌情況采用免疫組化SP法觀察。

1.6.3胰腺組織中氧化應(yīng)激損傷指標檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組大鼠胰腺組織中氧化應(yīng)激損傷指標MDA、T-SOD、TNF-α水平。

1.6.4胰島β細胞生長活力、存活率、凋亡率檢測將所分離的胰島β細胞使用不用濃度DEHP作用24 h、48 h、72 h，在試驗終止后加入20 μL MTT溶液，在37 ℃環(huán)境下進行孵育，孵育4 h后吸去上清液，使用PBS洗滌1次，加入150 μL DMSO做終止培養(yǎng)處理，振蕩0.5 h后測定每孔OD值，計算胰島β細胞存活率，重復(fù)進行3次，取平均值。使用TUNEL法檢測大鼠胰島β細胞凋亡率，在熒光顯微鏡下進行觀察計數(shù)，之后計算胰島β細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，重復(fù)進行3次，取平均值。

1.6.5胰腺組織中CN/NFAT信號通路蛋白表達量檢測 采用Western blot法檢測：將采集到的標本研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規(guī)蛋白提取，采取BCA法進行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液，在4 ℃的環(huán)境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白是GAPDH。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠糖脂代謝指標比較 模型組大鼠血清FPG、TC、TG、LDL-C水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05)； 消渴方組血清FPG、TC、TG、LDL-C水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，HDL-C水平明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠胰島功能指標比較 模型組大鼠血清FINS、HBCI、FBCI均明顯低于正常組(P均<0.05)，消渴方組均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

2.3各組大鼠胰腺組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠胰島組織形態(tài)、胰島素分泌量均正常；模型組大鼠胰島組織出現(xiàn)萎縮，細胞核顯著減少，胰島素分泌量顯著減少；消渴方組大鼠胰島組織形態(tài)與正常組大鼠胰島組織形態(tài)相似，胰島素分泌量增加。見圖1及圖2。

2.4各組大鼠胰腺組織中氧化應(yīng)激損傷指標比較 模型組大鼠胰腺組織中MDA、TNF-α均明顯高于正常組(P均<0.05)，消渴方組均明顯低于模型組(P均<0.05)；模型組大鼠胰腺組織中T-SOD明顯低于正常組(P<0.05)，消渴方組明顯高于模型組(P<0.05)。見表3。

表1 各組大鼠糖脂代謝指標比較

表2 各組大鼠胰島功能指標比較

2.5各組大鼠胰島β細胞生長活力、存活率、凋亡率比較 模型組胰島β細胞生長活力、存活率均明顯低于正常組(P均<0.05)，凋亡率明顯高于正常組(P<0.05)；消渴方組胰島β細胞生長活力、存活率均明顯高于模型組(P均<0.05)，凋亡率明顯低于模型組(P<0.05)。見表4。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 各組大鼠胰島β細胞胰島素分泌量免疫組化染色表現(xiàn)(×400)

表3 各組大鼠胰腺組織中氧化應(yīng)激損傷指標比較

2.6各組大鼠胰腺組織中CN/NFAT信號通路蛋白表達量比較 模型組胰腺組織中CN、NFATc1、Bax蛋白表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，PDX-1、Bcl-2蛋白表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)；消渴方組胰腺組織中CN、NFATc1、Bax蛋白表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，PDX-1、Bcl-2蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表5及圖3。

表4 各組大鼠胰島β細胞生長活力、存活率、凋亡率比較

表5 各組大鼠胰腺組織中CN/NFAT信號通路蛋白表達量比較

圖3 各組大鼠胰腺組織中CN/NFAT信號通路蛋白表達情況

3 討 論

2型糖尿病在中醫(yī)學(xué)上屬于“消渴病”的范疇，此病的發(fā)生與飲食不節(jié)、先天不足、情志失調(diào)、房勞過度等相關(guān)，其主要病機為燥熱偏勝、陰津虧損，以燥熱為標、陰虛為本，與機體五臟均相關(guān)，以腎最為主要，消渴為病，較為難愈，且隨著病程延長，可引發(fā)其他疾病[6]。消渴方源于元代朱震亨《丹溪心法》，由黨參、麥冬、茯苓、知母、丹皮、澤瀉、天花粉、生地、生山藥、丹參等組成，具有生津潤燥、益氣養(yǎng)陰的作用[7-8]。消渴方中生地滋陰生津、清熱涼血，天花粉可生津止渴、行津液，知母生津潤燥、清熱瀉火，麥冬清熱解煩、養(yǎng)陰生津。劉雅凝[9]和陳文一等[10]采用消渴方加減治療氣滯血瘀型和熱盛傷津證2型糖尿病均取得較好療效，但并未明確其具體作用機制。本研究通過動物實驗進行了探討，以明確消渴方治療糖尿病的作用機制。

2型糖尿病屬于一種多基因遺傳性疾病，其發(fā)病與胰島素抵抗、胰島素分泌不足有關(guān)，上述生理病理變化表現(xiàn)為胰島β細胞功能異常和胰島β細胞減少，而胰島β細胞減少與其凋亡相關(guān)，且引發(fā)胰島β細胞凋亡的原因包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、糖脂毒性等[11-13]。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清FPG、TC、TG、LDL-C水平及胰腺組織中MDA、TNF-α和胰島β細胞凋亡率均明顯升高，血清HDL-C、FINS、HBCI、FBCI及胰腺組織中T-SOD和胰島β細胞生長活力、存活率均明顯降低；與模型組比較，消渴方組大鼠各指標均較模型組明顯改善，且病理觀察消渴方組大鼠胰島組織形態(tài)與正常組相似，胰島素分泌量增加。提示消渴方可改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝及胰島功能，減輕胰腺氧化應(yīng)激損傷，促進大鼠胰島β細胞再生分化成熟，抑制胰島β細胞凋亡。

CN/NFAT信號通路中的CN屬于一種唯一受Ca2+/鈣調(diào)素活化的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其氨基酸序列具有較高的同源性，在組織中廣泛分布，其中以T淋巴細胞、神經(jīng)組織細胞中分布最多，在胰腺β細胞、肝組織、肺組織、脾組織中均存在，可調(diào)節(jié)多種細胞功能[14-16]。NFAT具有廣泛的生理功能，包括NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5等成員，NFATc是CN下游的重要調(diào)控作用靶點，在胰臟、心臟、神經(jīng)、平滑肌等細胞中存在，可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，CN/NFAT信號通路可調(diào)控胰島β細胞生物學(xué)行為[20]。本實驗結(jié)果顯示，模型組胰腺組織中CN、NFATc1、Bax蛋白表達量均明顯高于正常組，PDX-1、Bcl-2蛋白表達量均明顯低于正常組，消渴方組胰腺組織中各指標均較模型組明顯改善，提示消渴方可能通過阻斷CN/NFAT信號通路而發(fā)揮治療治療作用。

綜上所述，消渴方可能通過阻斷CN/NFAT信號通路而改善2型糖尿病大鼠胰島功能，減輕胰腺氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進胰島β細胞再生分化成熟，抑制胰島β細胞凋亡。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。