王文輝，郭 剛，李長文，陳 良

1 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2 定西市第二人民醫(yī)院；3 定西市人民醫(yī)院

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一種由于軀體感覺神經(jīng)損傷或障礙引起的全球性的疼痛疾病，目前仍無可靠的治療方法，不僅嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［1］，給個人、家庭和社會也帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［2］，而且可誘發(fā)患者焦慮、抑郁等負(fù)面情緒。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國目前NP 患者至少有1600萬［3］，而且隨著年齡的增長而增加；同時NP 的具體發(fā)病機制不清，使得目前缺乏有效的治療手段，因此，尋找有效的治療方法具有重要的意義。

疼痛是機體的自我保護性機制，主要表現(xiàn)為離子通道的改變、局部神經(jīng)炎癥、異位刺激和錯誤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［4］。隨著對神經(jīng)病理性疼痛研究的不斷深入，藥物治療的新靶點不斷被發(fā)現(xiàn)，如小膠質(zhì)細(xì)胞通路［5］、Notch 信號通路［6］、P38MAPK 通路［7］、Wnt 信號通路等［8］。研究還發(fā)現(xiàn)，在 NP 的神經(jīng)性炎癥發(fā)展中Wnt/β-catenin 信號通路可能起到重要的作用［9］，Wnt/β-catenin信號通路會導(dǎo)致與NP有關(guān)的炎性因子的過表達(dá)等［10］。

青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取出的具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理作用的生物堿單體［11-13］，臨床廣泛應(yīng)用于急性關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疼痛性自身免疫疾病的治療［14-15］。但是單純的藥物治療無法完全逆轉(zhuǎn)患者疼痛的病理過程，脈沖射頻聯(lián)合藥物治療是近年應(yīng)用較為廣泛的一種治療神經(jīng)性疼痛性疾病的方法，且療效較佳［16-17］。但是青藤堿聯(lián)合脈沖射頻治療法對神經(jīng)病理性疼痛的治療效果尚無報道，本研究利用青藤堿及脈沖射頻治療法治療脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）持續(xù)性術(shù)后疼痛大鼠，探討該療法通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路對大鼠SNL后神經(jīng)痛的治療效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器青藤堿（115-53-7，上海源葉生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（Beyotime，中國江蘇，批號：P0013B）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，批號：P0010）、增強型化學(xué)發(fā)光試劑（Beyotime，批號 ：P0018）、PVDF 膜（Merck Millipore，批號：HVHP29325）、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（Beyotime，批號：P0012A）；兔抗C-fos 多克隆抗體（Abcam，批號：ab209794）；兔抗 Wnt-3α 多克隆抗體（Abcam，批號：ab32249）；兔抗β-catenin 多克隆抗體（Abcam，批號：ab16051）；Trizol（Takara，批號：9109）；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，批號：RR047A）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Takara，批號：RR820L）。

1.2 實驗動物采用8 周齡SD 雄性大鼠135 只，體質(zhì)量約180～200 g，購自蘭州大學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2018-0002。飼養(yǎng)條件：在室溫下給予正常完全營養(yǎng)和自來水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食進水，光照周期12 h/12 h。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組方法 采用隨機數(shù)字表法將135 只大鼠分為5 組：假手術(shù)組、模型組、青藤堿組、射頻治療組及聯(lián)合治療組。見表1。

表1 實驗大鼠分組方法 只

1.3.2 模型制備 將SD 大鼠麻醉后進行脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）模型制備，沿L4～S1棘突做后正中偏右切口，暴露橫突的根部，用彎成直角的針頭向頭端插入孔內(nèi)。當(dāng)針頭觸及DRG 或神經(jīng)根可引起同側(cè)后肢肌肉輕微抽動，退出針頭。結(jié)扎神經(jīng)，縫合，腹腔連續(xù)3 天注射青霉素。假手術(shù)組除不進行背根神經(jīng)結(jié)扎外，其余操作同其他組。

1.3.3 給藥方法 術(shù)后第1 天開始（SNL 當(dāng)天視第 0 天）進行藥物［青藤堿 8 mg/（kg·d）］或/和脈沖射頻治療（在背根神經(jīng)結(jié)扎近端，距線結(jié)5 mm處，脈寬20 ms、頻率500 kHz，脈沖頻率2 Hz，溫度42℃，持續(xù)時間8 min）。假手術(shù)組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3.4 機械痛閾測量 所有大鼠在手術(shù)前1 天及術(shù)后第1、3、5、7、14 天給藥或/和脈沖射頻干預(yù)治療2 h后，檢測各組大鼠進行機械縮足反應(yīng)閾值（mechanical withdraw threshold，MWT）。每只大鼠每次檢測3 次，記下數(shù)值后求其均值，每次間斷開5 min。

1.3.5 樣品采集 各組大鼠SNL 術(shù)后3、7、14 天行為能力測試結(jié)束后，各組取6 只大鼠麻醉后處死，快速而準(zhǔn)確地切取各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）的 L4～L6節(jié)段，立即置于液氮中凍存用于Western Blot 及PCR 檢測。另取3 只大鼠麻醉后，開胸經(jīng)左心室插管進入主動脈根部，剪開右心耳，灌注PBS 沖盡血液，然后采用4℃4%多聚甲醛300 mL 灌注固定1 h。取L4～5節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)，用于免疫組化檢測。

1.3.6 Q-PCR 實驗 取收集到的DRG，采用Trizol 法提取 DRG 中總 RNA。并將 RNA 濃度統(tǒng)一稀釋至500 ng/mL，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA 作為模板，擴增白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因。擴增引物序列表見表2。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃10 min，1個循環(huán)；熱循環(huán)，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，40個循環(huán)，擴增結(jié)束后確認(rèn)擴增曲線和溶解曲線，確認(rèn)得出數(shù)據(jù)的可信性。計算基因的相對表達(dá)量F=2-△△Ct，△△Ct=（待測樣品的目的基因的Ct 的平均值-待測樣本的內(nèi)參基因的Ct 的平均值）-（對照樣品的目的基因的Ct的平均值-對照樣本的內(nèi)參基因的Ct的平均值）。

表2 引物序列

1.3.7 Western bloting實驗 取收集到的DRG，向DRG中加入200 μL蛋白裂解液（含1 mmol/L PMSF），置冰上 20 min 后，離心半徑 50 mm，12 000 r/min，離心15 min，取上清液。用BCA 測定蛋白濃度后調(diào)節(jié)至統(tǒng)一濃度。取20 μg 蛋白樣品（12%SDSPAGE，5%脫脂奶粉；90 V，轉(zhuǎn)膜 60 min）室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜兔抗Wnt-3α、β-catenin 多克隆抗體，TBST 洗膜 3 次，10 min/次，二抗室溫孵育 1 h（二抗：山羊抗兔 1∶8000），TBST 洗膜 3 次，10 min/次，用Western blot印跡法觀察并進行半定量分析。條帶采用ImageJ 軟件進行灰度值分析。

1.3.8 免疫組化實驗 取收集到的DRG，將DRG放入4℃4%多聚甲醛中固定6 h，再放入30%蔗糖4℃過夜，然后將組織包埋成石蠟塊，切片、爬片、脫臘后按照免疫組化試劑盒（中杉金橋）進行免疫組化。在倒置顯微鏡下觀察c-fos蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機械痛閾行為測試結(jié)果顯示，5 組大鼠痛閾基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。假手術(shù)組MWT隨時間無明顯變化，其他各組MWT在術(shù)后5 天持續(xù)下降，隨后出現(xiàn)回升趨勢；聯(lián)合治療組下降幅度最小，而上升幅度最大。與假手術(shù)組相比，其他各組MWT 在術(shù)后均顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）。與模型組相比，各治療組MWT 在術(shù)后下降幅度較小，而上升幅度較大。見表3。

表3 各組大鼠機械痛閾值比較（）

表3 各組大鼠機械痛閾值比較（）

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；▲表示與本組造模后1天比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組青藤堿組脈沖射頻組聯(lián)合治療組術(shù)后14 d 16.26±1.54 7.38±0.08*▲8.46±0.30*#9.31±1.23*#10.25±1.89*#鼠數(shù)6 6 6 6 6術(shù)前1 d 15.82±0.89 16.15±0.21 15.91±1.05 15.75±1.23 16.06±0.88術(shù)后1 d 15.53±0.12 9.35±0.25*9.41±0.09*9.49±0.28*9.58±0.87*術(shù)后3 d 14.5±0.74 8.21±0.56*8.56±0.05*8.86±0.47*9.01±0.92*#術(shù)后5 d 15.15±1.06 7.20±0.36*▲7.79±0.14*▲8.16±0.85*▲8.32±0.96*#▲術(shù)后7 d 15.83±1.05 7.31±0.58*▲7.82±0.24*▲8.31±0.85*#▲8.51±1.23*#

2.2 TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組IL-1β、TNF-α mRNA 相對表達(dá)量顯著升高，并隨時間的加長逐漸升高；與模型組比較，各治療組IL-1β、TNF-αmRNA 表達(dá)隨著治療時間的增長而顯著降低，聯(lián)合治療組下降幅度最大。按照不同治療時長分類，發(fā)現(xiàn)在手術(shù)后3 天各組間IL-1β、TNF-α 基因相對表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）；在第 7 天時除模型組外，各治療組 IL-1β、TNF-α 基因相對表達(dá)量開始下降；14 天下降更為顯著，其中聯(lián)合治療組表達(dá)量下降最為顯著。見圖1。

2.3 c-fos 蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組c-fos 蛋白相對表達(dá)量明顯升高，并隨時間的增長逐漸升高；與模型組比較，各治療組c-fos 蛋白相對表達(dá)量隨著治療時間的增長而顯著降低，其中在同一時間青藤堿組下降幅度最小，聯(lián)合治療組下降幅度最大。見圖2—3。

圖1 各組脊髓背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1β mRNA的相對表達(dá)量比較

圖2 脊髓背根神經(jīng)節(jié)中c-fos蛋白的相對表達(dá)

圖3 各組脊髓背根神經(jīng)節(jié)中c-fos蛋白的相對表達(dá)比較

2.4 Wnt-3α、β-catenin 蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組Wnt-3α、β-catenin 蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），但隨時間的加長差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，各治療組Wnt-3α、β-catenin 蛋白表達(dá)量均隨時間增長而顯著下降（P＜0.05），其中在同一時間下聯(lián)合治療組下降幅度最大。見圖4—5。

圖4 脊髓背根神經(jīng)節(jié)中Wnt-3α、β-atenin蛋白的相對表達(dá)

圖5 各組脊髓背根神經(jīng)節(jié)中Wnt-3α、β-catenin蛋白的相對表達(dá)比較

3 討論

NP 是由于神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或產(chǎn)生病變而引起的疼痛［18］，通常定義為由外周或中樞神經(jīng)疾病及損傷引起的慢性疼痛綜合征，其主要特征有痛覺過敏、自發(fā)性痛及異常痛［19-20］。由于NP 的發(fā)病機制復(fù)雜、難以治愈、患病率高等，人們將其稱為“不死的癌癥”，聯(lián)合用藥是目前比較有效的治療NP 的途徑［21-22］。青藤堿通常被用于抗炎止疼［23］，脈沖射頻對神經(jīng)疼痛的治療具有顯著的效果［24］。因此，本研究通過構(gòu)建SNL 持續(xù)性術(shù)后疼痛大鼠模型，利用青藤堿、脈沖射頻治療法及兩者聯(lián)合治療法3 種方法進行治療，觀察青藤堿聯(lián)合脈沖射頻治療法通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路對大鼠SNL 后神經(jīng)痛的治療效果。MWT 評價治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青藤堿聯(lián)合脈沖射頻療法治療NP 的效果最佳。

神經(jīng)疼痛是神經(jīng)炎癥的主要特征，是一種周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部炎癥［25］。本研究結(jié)果顯示，大鼠SNL 模型組中與NP 有關(guān)的炎性因子IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量顯著升高，并隨時間的加長逐漸升高；與模型組相比，各治療組IL-1β、TNF-α mRNA 表達(dá)隨著治療時間的增長而顯著降低，而聯(lián)合治療組脊髓背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1βmRNA 的表達(dá)顯著低于其他各組。提示NP 的產(chǎn)生和維持可能與炎癥因子過表達(dá)密切相關(guān)，聯(lián)合治療組能有效的抑制炎癥因子的合成與釋放，從而緩解NP 的維持。進一步研究發(fā)現(xiàn)各治療組脊髓背根神經(jīng)節(jié)中c-fos 蛋白的表達(dá)隨著時間的增長而降低，其中聯(lián)合治療組下降的幅度最大，提示青藤堿聯(lián)合脈沖射頻療法能有效的緩解NP 的發(fā)展與維持。

本研究檢測了SNL大鼠背根神經(jīng)節(jié)中Wnt/βcatenin 信號通路相關(guān)因子 Wnt-3α 和β-catenin蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大鼠SNL 模型組中Wnt-3α和β-catenin 蛋白的相對表達(dá)量顯著升高；與模型組相比，各治療組Wnt-3α 和β-catenin 蛋白的相對表達(dá)顯著降低，而聯(lián)合治療組脊髓背根神經(jīng)節(jié)中Wnt-3α 和β-catenin 蛋白的相對表達(dá)顯著低于其他各組。提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路在神經(jīng)損傷大鼠背根神經(jīng)節(jié)中被廣泛激活，可能與NP 的產(chǎn)生和維持有關(guān)；聯(lián)合治療組能有效的抑制Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)因子 Wnt-3α 和βcatenin 蛋白的相對表達(dá)。Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進化中極為保守的通路［4］，但是當(dāng)細(xì)胞外 Wnt 信號被激活后，Wnt 配體與富含半胱氨酸的卷曲區(qū)域受體和FZ 供受體結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)中β-catenin 積累起來，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)和目的基因的轉(zhuǎn)錄。以上提示，青藤堿聯(lián)合脈沖射頻法可能通過調(diào)節(jié)富含半胱氨酸的卷曲區(qū)域受體和FZ供受體，抑制Wnt的活性、使β-catenin 降解，從而影響神經(jīng)損傷后NP 的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，青藤堿聯(lián)合脈沖射頻療法能顯著降低SNL大鼠背根神經(jīng)節(jié)中炎癥相關(guān)因子和c-fos的表達(dá)及Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而的緩解SNL 大鼠神經(jīng)痛，提示青藤堿聯(lián)合脈沖射頻療法通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，可影響炎癥因子和c-fos 的表達(dá)而參與NP的發(fā)生發(fā)展，從而緩解SNL大鼠疼痛。