仇曉霞，史曉敏

西北民族大學直屬附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

宮頸癌是臨床常見的婦科腫瘤疾病，有研究顯示Th22細胞可通過活化AKT信號通路促進宮頸癌細胞增殖，AKT 信號通路在多種腫瘤中均與腫瘤細胞增殖凋亡有關(guān)［1］。通過干預這一信號通路，可以調(diào)控腫瘤細胞增殖、誘導凋亡，影響癌癥進展［2］。細胞周期蛋白 1（cell cycle protein 1，Cyclin-D1）是調(diào)節(jié)細胞周期G1期的一種蛋白，在正常人群中，其表達量較低或不表達［3］。有研究顯示［4］，Cyclin-D1在宮頸癌細胞中表達量與正常人群比較具有顯著差異，呈明顯高表達狀態(tài)。推測Cyclin-D1 蛋白可通過干擾細胞周期引發(fā)腫瘤細胞增殖失控。目前臨床對宮頸癌的治療方法主要包括手術(shù)、放化療，但治療后存在較明顯的手術(shù)創(chuàng)傷性、放化療不良反應等并發(fā)癥。尋找更有效、不良反應更少的新治療方法一直是臨床研究治療該病的熱點課題。中醫(yī)認為宮頸癌是因人正氣內(nèi)虛、免疫力降低、外邪入侵傷及胞體導致［5］。紫草具有活血解毒、透疹消斑等效用［6］。其有效化學成分為紫草素，已被證實在促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡實驗中發(fā)揮重要作用［7］。本研究將紫草素作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌細胞，觀察細胞凋亡情況，探討紫草素對宮頸癌細胞的作用是否與AKT通路、Cyclin-D1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人宮頸癌海拉（Hela）細胞（上海研生實業(yè)有限公司，批號：ZKCC-X1651）；DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生物，批號：20190420）；胎牛血清（FBS）（賽默飛世爾中國，批號：20190711）；胰蛋白酶-EDTA 消化液、蛋白質(zhì)提取試劑盒（Solarbio公司，批號：20190404、20190705）；兔源 AkT 多克隆抗體、兔源磷酸化AKT（p-AKT）多克隆抗體、兔多克隆Cyclin-D1 抗體（LSBio，批號：20180709）；總 RNA 提取劑 Trizol（Sangon Biotech，批號 ：20181227）；紫草素粉（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：20190707）；四唑鹽（MTT）溶液（上海酶聯(lián)生物，批號：201811122）。

1.2 實驗儀器H3-6815-02 型5% CO2恒溫培養(yǎng)箱（Asone），UV752 型分光光度計（山東博科科學儀器有限公司），7500 型實時熒光定量PCR 儀（ABI），DNM-9602型酶標儀（北京普朗醫(yī)療）。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物配制 取10 mg紫草素粉，加入100 μL二甲基亞砜溶液，制成濃度為100 mg/mL的紫草素溶液，將紫草素溶液加入DMEM 培養(yǎng)液中，制成終濃度為8、16、32 μmol/L的溶液。

1.3.2 分組及給藥 將Hela 細胞接種于含有10%FBS 的 DEME 培養(yǎng)基中 ，于 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)期。取對數(shù)期Hela 細胞，加入10 μL 胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，離心半徑：13.5 cm，1200 r/min（RCF=1350 g），離心 5 min，棄去上清液，接種于96 孔板中，每孔1×104個細胞、100 μL DMEM 培養(yǎng)液。繼續(xù)于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當細胞生長至80%左右，將細胞分為低濃度組、中濃度組、高濃度組、空白組。各濃度組分別加入濃度為8、16、32 μmol/L的紫草素DMEM細胞培養(yǎng)液，空白組加入不含紫草素DEME 培養(yǎng)液，100 μL/孔，繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組設置3個復孔。

1.4 觀察指標

1.4.1 細胞凋亡率 各組繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，向每組細胞內(nèi)加入 MTT 溶液 10 μL 顯色，孵育4 h 后，設置調(diào)零孔、溶媒孔、加藥孔，采用酶標儀檢測每組在490 nm 處吸光度，每組重復測3 次取均值。MTT 結(jié)果中，吸光度越大，表示活細胞數(shù)量越多，計算每組細胞凋亡率。細胞凋亡率=1-（加藥孔吸光度均值-調(diào)零孔吸光度均值）/（溶媒孔吸光度均值-調(diào)零孔吸光度均值）×100%。

1.4.2 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA 表達量 采用實時熒光定量PCR儀檢測各組AKT、p-AKT、細胞周期蛋白D1 信使核糖核酸（Cyclin-Dlmessenger RNA，Cyclin-D1mRNA）蛋白表達量：采用 Trizol 提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR 反應條件為95℃ 30 s 預變性、95℃ 10 min 變性、95℃ 15 s 退火、60℃1 min 延伸、95℃10 min 再延伸，循環(huán) 40次。將反應體系放入PCR 儀，定量測定目標基因mRNA 表達量，計算△△Ct值=每組△Ct值-空白組△Ct值，以2-△△Ct值表示目標基因mRNA量。見表1。

表1 引物序列

1.4.3 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白表達量 采用 Western Blotting 法 檢 測 各 組 AKT、p-AKT、Cyclin-D1蛋白表達量，再采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法及凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用snk-q 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞凋亡率48 h 時空白組最大凋亡率為（12.37±0.29）%，低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞凋亡率均隨著時間推移而升高，高濃度組在24、48、72 h凋亡率均明顯較高。見圖1。

圖1 各組細胞凋亡率

2.2 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA表達量細胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA 表達量隨著濃度的增高而減少，高濃度組均明顯低于其他各組（P＜0.05）；中濃度組均明顯低于低濃度組及空白組（P＜0.05）；低濃度組表達量低于空白組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA表達量

2.3 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白表達量AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白量隨著濃度的增高而減少，高濃度組均明顯低于其他各組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1蛋白表達量

3 討論

在婦科常見腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，呈逐年升高、年輕化趨勢。采用根治性手術(shù)可治療大部分早期宮頸癌患者，對于中晚期患者而言，可采用手術(shù)、放化療聯(lián)合治療，但可能出現(xiàn)多種手術(shù)并發(fā)癥、放化療不良反應。有研究［8，17］從中藥中提取有效成分作為中藥單體，應用于腫瘤細胞，取得了較好的促腫瘤細胞凋亡效果。李靜等［9］發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖與大黃素對口腔癌細胞有明顯抑制作用。馬程遙等［10］研究表明番茄枝內(nèi)酯對乳腺癌細胞有抑制作用。譚大清等［11］研究表示藤黃酸對膀胱癌細胞有明顯的抑制作用。

根據(jù)中醫(yī)對宮頸癌的癥狀及已有文獻記載的治療方法，本研究選取了中藥紫草的中藥單體作為抗腫瘤藥物。紫草味甘、性寒，臨床常用于治療濕疹、紫癜、血尿、燒傷、黃疸［12-13］等。本研究在前期細胞增殖凋亡實驗中，已顯示出不同濃度紫草素細胞培養(yǎng)液對宮頸癌細胞Hela 的增殖均有抑制作用，且這一抑制作用具有濃度依賴性，在作用24 h 后，高濃度組即可表現(xiàn)出較高的促腫瘤細胞凋亡率。但由于本研究設置組別有限，未能就多種不同梯度的紫草素濃度對Hela 細胞的抑制作用進行分析，也未能得到最佳抑制濃度。在后續(xù)實驗研究中，還需進一步對紫草素抑制Hela 細胞的最佳濃度進行探究。

紫草素對宮頸癌細胞具有較好的抑制作用被證實后，進一步分析宮頸癌發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)紫草素的抑制腫瘤細胞增殖作用可能與常見調(diào)控腫瘤細胞增殖AKT 信號通路及細胞周期相關(guān)蛋白有關(guān)。通過對不同濃度紫草素作用后Hela細胞AKT、pAKT表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)空白組AKT、p-AKT mRNA 及蛋白均高表達，低濃度、中濃度組及高濃度組AKT、p-AKT mRNA 及蛋白較空白組明顯降低，且降低幅度隨濃度升高而增大，高濃度組AKT、p-AKT mRNA 及蛋白表現(xiàn)出明顯低表達。AKT 信號通路是腫瘤細胞重要的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，被活化的AKT 可增加核轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進腫瘤細胞胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運，同時激活基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)，便于腫瘤細胞增殖侵襲［14］。因此本研究結(jié)果提示紫草素可通過抑制AKT 信號通路的促腫瘤細胞增殖作用，達到抑制腫瘤的目的。同時，不同組細胞的Cyclin-D1 mRNA及蛋白表達量分析結(jié)果顯示與AKT 表達結(jié)果相似，Cyclin-D1 mRNA及蛋白表達量在被紫草素作用后的各組Hela 細胞中均明顯降低。表明紫草素對Cyclin-D1 蛋白也具有抑制作用。Cyclin-D1 在細胞周期中，可與細胞周期蛋白依賴激酶結(jié)合，使細胞從G1期進入S 期，進而使細胞分化增殖［15-17］。正常狀態(tài)下Cyclin-D1 表達量處于穩(wěn)定狀態(tài)，過表達的Cyclin-D1會使細胞周期紊亂，細胞不斷從G1期進入S 期，導致腫瘤細胞增殖分化速度加快。本研究結(jié)果還表明紫草素可通過抑制Cyclin-D1表達，實現(xiàn)抗腫瘤效應。

綜上所述，紫草素對宮頸癌Hela 細胞具有明顯抑制增殖作用，且這一作用呈濃度依賴性。紫草素對Hela 細胞增殖的抑制作用可能是通過抑制ATK 信號轉(zhuǎn)導通路及Cyclin-D1 蛋白表達而實現(xiàn)的。