董雙濤，李寶霞，沈丹丹，趙麗元，張春泓，馬 鄭

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031;2.大連市藥品檢驗(yàn)所，遼寧 大連 116021)

鹽酸奧洛他定滴眼液是一種新型的組胺受體阻斷劑，用于過敏性結(jié)膜炎的治療[1]，不良反應(yīng)以頭痛、困倦較為常見[2]。鹽酸奧洛他定滴眼液率先由諾華制藥研發(fā)生產(chǎn)，于2004年在美國(guó)上市。鹽酸奧洛他定相關(guān)制劑是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局下達(dá)的藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種。本研究抽取全國(guó)范圍內(nèi)的樣品，由藥品監(jiān)管部門為實(shí)施主體，可以公平、客觀、全面的評(píng)價(jià)該品種的仿制藥，以達(dá)到修訂藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，協(xié)助企業(yè)提升藥品質(zhì)量的目的。由于這些品種已經(jīng)通過藥學(xué)評(píng)審，達(dá)到了仿制藥上市的技術(shù)要求。但由于當(dāng)時(shí)審評(píng)理念和科學(xué)認(rèn)知的局限，往往存在一定風(fēng)險(xiǎn)隱患，如滴眼劑中的抑菌劑、注射劑的抗氧劑等研究往往不夠充分。因此在評(píng)價(jià)方法上，既要能夠識(shí)別出仿制品存在的高風(fēng)險(xiǎn)隱患，切實(shí)保證人民群眾用藥安全，又要高效并可實(shí)施。2018年大連市藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)了鹽酸奧洛他定滴眼劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)工作。課題組提出基于風(fēng)險(xiǎn)控制理念的評(píng)價(jià)方法[3]，研究首先基于現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)分析，然后開展探索性研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waterse2695高效液相色譜儀器，配備2998型二極管陣列檢測(cè)器、生物安全柜(thermo Scientific)、電子恒溫箱(上海成順)、高壓蒸汽滅菌器(Tomy autoclave ss-325)、GC-MSQP2020氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀(日本島津公司)、NexIon300X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)PE公司)、MSA225S-100-DA型分析天平(德國(guó)sartrious公司)、Milli-Q Academic超純水儀(美國(guó)Millpore公司)。

1.2 藥品與試劑菌種：大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]第3代、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]第3代、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]第3代、白色念珠菌(Candida albicans)[C MCC(F)98001]第3代、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]第3代。

培養(yǎng)基：胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，上述均購(gòu)自北京奧博星有限公司。

苯扎氯銨系列對(duì)照品：十二烷基二甲基芐基氯化銨(C12苯扎氯銨)，批號(hào)：1-JYP-14-1、純度：98.0%;十四烷基二甲基芐基氯化銨(C14苯扎氯銨)，批號(hào)：2-KAA-136-1，純度：98.0%，來源：TRC。

單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：鉛(批號(hào)163063-1)、鎘(批號(hào)171037-2)、砷(批號(hào)156014-2)、銅(批號(hào)171048-2)、汞(批號(hào)163019-2)、錸(批號(hào)157028)、銠(批號(hào)171005)，均來源于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，濃度：1000 μg/mL，硝酸為優(yōu)級(jí)純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

塑化劑對(duì)照品：鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(DEHP)，鄰苯二甲酸二正戊酯(DAP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正丙酯(DPP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二正己酯(DHP)、鄰苯二甲酸戊基異戊酯(DnIPP)(上述標(biāo)準(zhǔn)品來源于Dr.Ehrenstorfer GmbH)。

有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品：鹽酸奧洛他定雜質(zhì)E(批號(hào)101099-200901，來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院);鹽酸奧洛他定雜質(zhì)C(批號(hào)：R065M0，來源：USP，含量99.0%);鹽酸奧洛他定雜質(zhì)B(批號(hào)：R077Q0，來源：USP，含量：100.0%);鹽酸奧洛他定雜質(zhì)甲醛衍生物(批號(hào)：1-VHP-134-4，來源：Toronto Research Chemicals，含量97.0%)。鹽酸奧洛他定對(duì)照品(批號(hào)：R058Q0，來源：USP，含量：99.9%)。

1.3 樣品鹽酸奧洛他定滴眼液(國(guó)產(chǎn)某廠家，規(guī)格5 mL：5 mg，批號(hào)170558、170733、170459、170460、170674、170622、170689、1701015、1701071)。原研制劑(諾華制藥生產(chǎn)，規(guī)格5 mL：5 mg，批號(hào)17G06AA，17H02AG)。

2 方法與結(jié)果

2.1 法定檢驗(yàn)首先依照法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定滴眼液一批次不合格，不合格項(xiàng)為裝量。從“檢測(cè)結(jié)果”角度衡量，國(guó)產(chǎn)制劑質(zhì)量良好。研究中發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)滴眼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)控制不嚴(yán)，如標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)特定雜質(zhì)進(jìn)行控制。

2.2 探索性研究探索性研究首先針對(duì)法定檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題。其次，也關(guān)注藥品整個(gè)生命周期高風(fēng)險(xiǎn)因素，兼顧我國(guó)監(jiān)管方向，開展針對(duì)性研究。研究?jī)?nèi)容包括原料藥及制劑的有關(guān)物質(zhì)研究、制劑抑菌劑及抑菌效力的研究、包材的研究、毒性元素的研究，對(duì)于建立的方法均進(jìn)行了方法學(xué)考察。

2.3 有關(guān)物質(zhì)的對(duì)比研究本研究建立了新的有關(guān)物質(zhì)檢查法，對(duì)原料和制劑檢測(cè)分析，該法專屬、靈敏。色譜條件為辛基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Intertsil C8，5 μm，4.6 mm×250 mm);以0.5 %十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽溶液和乙腈的混合溶液[稱取十二烷基硫酸鈉5.0 g，用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.5)-乙腈(55:45)的混合溶液溶解并稀釋至1000 mL]為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為299 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量50 μL。方法學(xué)驗(yàn)證表明，本法專屬、靈敏[4]。

2.4 抑菌劑研究抑菌劑對(duì)本品安全、有效性均有較大影響，也是近年來監(jiān)管的主要關(guān)注點(diǎn)。探索性研究中開展了與原研制劑抑菌劑的種類、含量的對(duì)比研究，抑菌效力研究。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：CN柱，SHISEIDO 5 μm 4.6 mm×250 mm，流動(dòng)相：乙腈-0.1 mol/L醋酸銨緩沖溶液(pH5.0)(65:35)。檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積：20 μL。

2.4.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備 C12苯扎氯銨對(duì)照品49.90 mg、C14苯扎氯銨對(duì)照品49.99 mg，置同一50 mL棕色量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為含量測(cè)定對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：直接取滴眼劑作為供試品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

2.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL、5 mL、8 mL、10 mL，分別置100 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液③、④、⑤、⑥。精密量取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液⑥1.0 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液②。精密量取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液④1.0 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液①。

照“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣分析：C12苯扎氯銨在4.880-146.41 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=978x+836(r=0.9999);C14苯扎氯銨在5.218-156.53 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=930x+111(r=0.9997)。

2.4.3.2 回收率 精密稱取對(duì)照品適量，制成回收率測(cè)試對(duì)照品溶液。取空白輔料溶液，向其中加入低中高三個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，制成低中高三個(gè)濃度水平的回收率測(cè)試溶液，依法測(cè)定，結(jié)果如表1中所示，表明該法平均回收率為99.7%，表明本法準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3.3 系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 精密量取同一批號(hào)(批號(hào)170558)供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，各峰面積的RSD小于0.8%，表明本法精密度良好。

2.4.3.4 定量限與檢測(cè)限 精密量取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析，使得峰高約為信噪比的10倍，測(cè)得C12，C14苯扎氯銨定量限濃度依次為0.7808 μg/mL，0.8213 μg/mL;同法逐級(jí)稀釋，使得峰高約為信噪比的3倍，測(cè)得C12，C14苯扎氯銨檢測(cè)限濃度為0.2342 μg/mL，0.2867 μg/mL。

2.4.3.5 專屬性 分別量取2.4項(xiàng)下的流動(dòng)相、樣品稀釋劑、苯扎氯銨對(duì)照品溶液、供試品溶液，依2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，各苯扎氯銨出峰位置無干擾，結(jié)果說明本法專屬性良好。

圖1 苯扎氯銨色譜圖

表2 抑菌劑含量測(cè)定結(jié)果 (μg/mL)

2.5 抑菌效力研究

2.5.1 菌液制備 取大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單孢菌，白色念珠菌的新鮮瓊脂培養(yǎng)物，加入適量0.9%無菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，將菌懸液移至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成約108 cfu/mL的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗下，即為108 cfu/mL的菌懸液。

2.5.2 測(cè)定方法 取樣品5支(5 mL/支)，將內(nèi)蓋拔出，分別加入上述制備的5種菌懸液各50 μL，蓋上內(nèi)蓋和外蓋，充分混勻，置24 ℃培養(yǎng)箱中避光貯存28 d。分別于6 h、24 h、7 d、14 d、28 d取溶液1 mL，稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5 5個(gè)稀釋濃度，分別1 mL/皿加入平皿中，2皿/稀釋級(jí)，金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌，銅綠假單孢菌分別加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，34 ℃培養(yǎng)48 h，白色念珠菌和黑曲霉加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，24 ℃培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)，結(jié)果見表3。

2.6 包材的研究近年來，EMA和FDA相繼發(fā)布指導(dǎo)原則，將包材作為眼用制劑的高風(fēng)險(xiǎn)因素。鹽酸奧洛他定滴眼液包材為低密度聚乙烯(LDPE)，可能存在遷移出塑化劑的風(fēng)險(xiǎn)。本研究開展了包材中可能存在的十種塑化劑的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及密閉性研究。

2.6.1 塑化劑研究 氣相色譜柱：甲基(5%苯基)聚硅氧烷為固定相SH-RXI-5sil(30 m，250 μm×0.25 μm);程序升溫，初始溫度為150 ℃，保持5 min，再以40 ℃/min升至220 ℃，保持15 min。進(jìn)樣口280 ℃，流速1.0 mL/min，電離方式EI，溶劑延遲5 min，分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電離能力70 eV，離子源溫度：250 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃。取十種塑化劑對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，以信噪比的3倍作為檢出限濃度，各化合物定性離子見表4。

表3 11批次樣品抑菌效力測(cè)定結(jié)果

表4 典型定性離子

2.6.2 密閉性研究 基于裝量不合格項(xiàng)針對(duì)性開展。測(cè)定法：取本品7支，將其置于用1%亞甲藍(lán)水溶液的容器內(nèi)，加擋板，使滴眼劑瓶完全浸沒，每天觀察。

2.7 毒性元素研究元素研究是滴眼劑中的高風(fēng)險(xiǎn)因素。ICH及各國(guó)藥政部門越來越重視該項(xiàng)研究。本文建立了ICP-MS法測(cè)定了四種毒性元素，并進(jìn)行了國(guó)產(chǎn)制劑與原研制劑的對(duì)比研究。

2.7.1 溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密量取各單元素溶液適量，加0.5 mol/L硝酸逐步稀釋，制成含Pb、As、Cd質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。同法制備濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0 μg/L Hg標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液(本溶液臨用新制)。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密量取錸(Re)、銠(Rh)元素溶液適量，加0.5 mol/L硝酸逐級(jí)稀釋制成含Re、Rh 20 μg/L的溶液。以Re為內(nèi)標(biāo)測(cè)定Hg、Pb元素，以Rh為內(nèi)標(biāo)測(cè)定As、Cd元素。

供試品溶液的制備：取本品5支混勻。精密量取2 mL置10 mL量瓶中，加0.5 mol/L硝酸稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

空白溶液的制備：直接取0.5 mol/L硝酸溶液作為空白溶液。

2.7.2 ICP-MS測(cè)定條件 功率1500 W，冷卻氣體流量14 L/min;霧化體積流量1.0 mL/min,采樣深度5 mm，掃描次數(shù)20;重復(fù)次數(shù)3;采用碰撞反應(yīng)池模式;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速40 r/min。

2.7.3 方法學(xué)考察

2.7.3.1 線性關(guān)系考察 照“2.7.2”項(xiàng)下的測(cè)定條件，依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各元素與響應(yīng)內(nèi)標(biāo)計(jì)數(shù)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各元素的回歸方程，相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果見表5。

表5 各元素的線性關(guān)系、檢測(cè)限及精密度

2.7.3.2 精密度試驗(yàn) 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣六次，測(cè)定各元素的量，RSD值在0.7%～2.6%之間，結(jié)果見表5表明儀器的精密度良好。

2.7.3.3 檢測(cè)限 連續(xù)測(cè)定樣品的空白溶液10次，測(cè)定元素的信號(hào)響應(yīng)值，以各元素與響應(yīng)內(nèi)標(biāo)計(jì)數(shù)值的比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(δ)的3倍所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，各元素的檢出限均能滿足分析要求。

2.7.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取本品，照”2.7.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別于制樣后的0、4、6、8、16、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定個(gè)元素的量，各元素的RSD在4.1%～4.9%，結(jié)果見表6，表明樣品在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取空白輔料溶液，分別精密加入各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，依法測(cè)定，計(jì)算平均回收率在95.2%～101.2%之間，RSD均小于5.0 %(n=6)，結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性及回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.7.3.6 樣品測(cè)定 取本品樣品，依各項(xiàng)下方法制備供試品溶液。結(jié)果見表7。綜上，結(jié)果說明：(1)國(guó)產(chǎn)制劑毒性元素的量略低于原研制劑一致。(2)國(guó)產(chǎn)制劑抑菌劑總濃度與原研制劑一致，但是同系物組成不同。進(jìn)一步抑菌效力研究結(jié)果表明，抑菌效力基本一致，結(jié)果見表5。(3)塑化劑均未檢出。

表7 各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 法定檢驗(yàn)國(guó)產(chǎn)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)總體可行，但建議提升和改進(jìn)有關(guān)物質(zhì)檢查法，對(duì)四種降解產(chǎn)物按加校正因子的主成分自身對(duì)照品進(jìn)行控制。其次，應(yīng)規(guī)定滲透壓摩爾濃度范圍。

3.2 探索性研究課題組結(jié)合多年研究實(shí)踐，參考ICH指導(dǎo)原則，提出基于風(fēng)險(xiǎn)控制理念的探索性研究思路。本研究的亮點(diǎn)在于研究理念，即不走推倒重來的激進(jìn)之路，也避免走研究不充分的老路。應(yīng)發(fā)揮監(jiān)管平臺(tái)優(yōu)勢(shì)，關(guān)注我國(guó)國(guó)情下的高風(fēng)險(xiǎn)因素，并將之貫穿于藥品整個(gè)生命周期，重點(diǎn)關(guān)注對(duì)安全性、有效性、質(zhì)量可控性有重大影響的高風(fēng)險(xiǎn)因素。表8歸納了這些高風(fēng)險(xiǎn)因素，并采取的技術(shù)手段及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除技術(shù)手段外，我們也對(duì)國(guó)產(chǎn)企業(yè)了實(shí)地調(diào)研，未發(fā)現(xiàn)問題。本研究全面評(píng)估國(guó)產(chǎn)制劑的質(zhì)量，并對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升。

表8 高風(fēng)險(xiǎn)因素及技術(shù)手段

3.3 抑菌劑研究鹽酸奧洛他定滴眼液抑菌效力均符合2015版《中國(guó)藥典》中<1121>抑菌效力檢查法[5]中有關(guān)眼用制劑的要求。所有批次的滴眼液對(duì)細(xì)菌(大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單孢菌)均有較強(qiáng)的抑制，在6 h均將所有的細(xì)菌完全殺死。差異主要在白色念珠菌和黑曲霉的抑制上，對(duì)于國(guó)產(chǎn)制劑9批次的樣品，在6 h白色念珠菌的抑制較弱，黑曲霉未完全抑制，而原研廠家的2批滴眼液在6 h時(shí)，白色念珠菌和黑曲霉均完全抑制。原因可能與兩個(gè)廠家所使用的苯扎氯銨不同有關(guān)，河北創(chuàng)健的抑菌劑為C12苯扎氯銨，而原研制劑為C14/C12苯扎氯銨，可能導(dǎo)致抑菌效力存在差異。按照中國(guó)藥典抑菌效力檢查法開展了抑菌效力實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示均達(dá)“A”級(jí)。因此在保證抑菌效力的情況下，采用較低濃度的苯扎氯銨有利于降低本品的毒性[6-7]。在后續(xù)的研究中，我們也開展了在多次給藥對(duì)兔眼的眼刺激性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明多次給藥對(duì)兔眼無刺激。本研究表明國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定滴眼劑中防腐劑種類、含量、抑菌效力均符合規(guī)定。

4 結(jié)論

國(guó)產(chǎn)奧洛他定滴眼劑的質(zhì)量為“良好”，但國(guó)產(chǎn)滴眼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要提升。本文基于風(fēng)險(xiǎn)控制理念，能夠全面、高效的評(píng)價(jià)國(guó)產(chǎn)藥品，適用于藥品監(jiān)督機(jī)構(gòu)的實(shí)施。本文中建立的有關(guān)物質(zhì)、毒性元素、塑化劑、抑菌劑檢查法專屬、靈敏，適用于鹽酸奧洛他定滴眼劑的分析。