孫士浩，馬曉琴，祁得勝，馬建濱

（青海師范大學(xué)，青海西寧 810008）

馬泡瓜（Cucumis melo L.var.agrestis Naud.）屬葫蘆科黃瓜屬植物，味甘、性涼、無毒性，具備清熱解毒、利尿等功效，民間常用其煮湯治療泌尿系統(tǒng)炎癥[1]。

尿路感染（Urinary tract infection，UTI）是臨床上常見的細(xì)菌感染疾病，發(fā)病率僅次于呼吸道感染[2]，致病菌多為革蘭氏陰性桿菌，最常見為大腸桿菌，常用廣譜抗菌藥物進(jìn)行治療。但泌尿道病原菌的耐藥性不斷變化，給臨床用藥帶來困難，也促使研究人員開始尋找一些療效較好、安全性較高的抗菌中草藥進(jìn)行開發(fā)和研究。目前，馬泡瓜在民間常作為中草藥偏方使用，通過查閱文獻(xiàn)，針對(duì)其在尿路感染方面的研究未見報(bào)道。本研究通過小鼠大腸桿菌泌尿道上行性感染模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察馬泡瓜多糖的抗尿路感染作用，旨在為其功效和應(yīng)用提供藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與菌種

馬泡瓜果實(shí)購(gòu)自山東單縣種植基地，切片后曬干備用。菌株有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，為實(shí)驗(yàn)室保藏菌。

乙醇，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；苯酚，分析純，無錫市晶科化工有限公司；硫酸，分析純，永飛化學(xué)試劑有限公司；左氧氟沙星片（批號(hào)B14202003159），第一三共制藥有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，按照文獻(xiàn)方法制作后備用[3]。

1.1.3 動(dòng)物

KM小鼠（雌性，體重20～22 g）及動(dòng)物飼料均由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，自由攝食和飲水。

1.2 方法

1.2.1 馬泡瓜多糖的制備

三是做大水利投融資平臺(tái)。省政府成立了省水利發(fā)展投資有限公司，注冊(cè)資本金50億元，主要由省財(cái)政注資，采取多元投資方式，省水利廳管理為主，通過市場(chǎng)融資，解決湖南省水利建設(shè)投入不足的問題。各市縣水利投融資平臺(tái)通過財(cái)政注入資金、金融機(jī)構(gòu)貸款、土地儲(chǔ)備等方式，融資90億元。

稱取馬泡瓜果實(shí)干片200 g，按料液比（干果實(shí)∶水）1∶10，浸泡過夜后煎煮2次，每次2 h。合并提取液，過濾后減壓濃縮至200 mL，濃縮液中加入95%乙醇使其醇濃度達(dá)到60%，靜置24 h，過濾后收集沉淀物并加水溶解，離心過濾后減壓濃縮至200 mL，加95%乙醇使含醇量達(dá)80%，靜置24 h，過濾，收集沉淀物，真空干燥，得馬泡瓜多糖提取物。采用苯酚-硫酸法[4]測(cè)定總糖含量。

1.2.2 抗菌活性的測(cè)定（打孔法）

挑取活化好的菌落，懸于無菌生理鹽水（高壓滅菌鍋121 ℃濕熱滅菌）中，調(diào)整菌液濁度與比濁管（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┫嗤錆舛燃s1×108CFU/mL，4 ℃冷藏備用。將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒入無菌平皿約15 mL，冷卻至50～60 ℃，凝固后取菌液0.2 mL于平皿中，涂布均勻。用無菌鑷子將滅菌后直徑6 mm的圓形濾紙片置入不同劑量的馬泡瓜多糖溶液中（空白組0 g/mL、低劑量0.250 g/mL、中劑量0.500 g/mL、高劑量1.000 g/mL），完全浸濕后取出，徹底揮干后貼于培養(yǎng)基表面，每種菌3次重復(fù)。在培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)1 d。取出培養(yǎng)皿后，肉眼觀察紙片周圍有無抑菌圈形成，若有抑菌圈則用游標(biāo)卡尺測(cè)其直徑，取3次測(cè)量的平均值[5]。

抑菌效果判定方法：抑菌圈直徑＞15 mm為高度敏感，用“+++”表示；10～15 mm為中度敏感，用“++”表示；7～9 mm為低度敏感，用“+”表示；無抑菌圈表示無抑菌作用，用“-”表示[6]。

1.2.3 小鼠泌尿系統(tǒng)感染實(shí)驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，利用針頭經(jīng)尿道插入膀胱注射菌液的方法，制造小鼠泌尿道上行性感染模型，從而研究受試藥物療效。選取健康小鼠70只，按體重隨機(jī)分成7組，每組10只。空白對(duì)照組1組，陽性對(duì)照藥物（左氧氟沙星）和受試藥物分別設(shè)高、中、低3個(gè)劑量組（2.000 g/mL、0.500 g/mL、0.125 g/mL）。禁水24 h，用戊巴比妥鈉溶液（70 mg/kg）腹腔麻醉，按壓腹部排盡余尿，用酒精消毒尿道口及周圍，將靜脈留置針緩緩插入尿道至膀胱底部，用注射器注入大腸桿菌菌液0.05 mL（濃度約1×108CFU/mL）感染。4 h后恢復(fù)正常飲水進(jìn)食。膀胱感染當(dāng)天開始灌胃給藥，每日給藥1次，連續(xù)4 d。陰性對(duì)照組給予等容積的生理鹽水。在第5 d斷頸處死小鼠，無菌環(huán)境中取出雙側(cè)腎臟，縱切成剖面，將剖面蓋印于平皿瓊脂培養(yǎng)基上。然后將腎臟放入無菌研磨器中，每1 g組織加入9 mL生理鹽水研磨，勻漿液適當(dāng)稀釋后涂布在平皿瓊脂培養(yǎng)基上。兩種平皿均置于37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)18 h，記錄活菌數(shù)并計(jì)算動(dòng)物的細(xì)胞數(shù)（CFU/g）。

腎剖面蓋印結(jié)果分級(jí)記錄標(biāo)準(zhǔn)[8]：“++++”為細(xì)菌密集生長(zhǎng)，范圍達(dá)接種面積的90%以上；“+++”為細(xì)菌大量生長(zhǎng)，出現(xiàn)的菌落無法計(jì)數(shù)；“++”為培養(yǎng)板上出現(xiàn)的菌落可計(jì)數(shù)，且≥20；“+”為培養(yǎng)板上出現(xiàn)的菌落數(shù)≥3且＜20；“±”為培養(yǎng)板上出現(xiàn)的菌落數(shù)＜3；“-”為培養(yǎng)板上無細(xì)菌生長(zhǎng)。

結(jié)果使用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，比較各組差異顯著性。由于腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)結(jié)果和腎剖面蓋印結(jié)果方差不齊，分別使用極差法檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取結(jié)果

經(jīng)過提取和純化，從馬泡瓜中得到較純的多糖，得率為27.5%。

2.2 抗菌活性測(cè)定結(jié)果

不同劑量馬泡瓜多糖抑菌圈直徑的比較結(jié)果見表1。從表1可以看出，馬泡瓜多糖的1.000 g/mL和0.500 g/mL劑量組對(duì)大腸桿菌的抑制效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑＞10 mm，屬中敏感度；0.250 g/mL劑量組對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑＞7 mm，屬低敏感度。馬泡瓜多糖的1.000 g/mL劑量組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑＞10 mm，屬中敏感度；0.500 g/mL劑量組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑＞7 mm，屬低敏感度；0.250 g/mL劑量組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑＜7 mm，無抑菌作用。

表1 不同劑量馬泡瓜多糖抑菌圈直徑比較 單位：mm

2.3 小鼠泌尿系統(tǒng)感染實(shí)驗(yàn)

受試藥物及陽性對(duì)照藥物對(duì)泌尿系統(tǒng)感染模型小鼠的療效見表2和表3。受試藥物高、中、低3個(gè)劑量組腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值與對(duì)照組相比，分別下降了2.51、0.56、0.50，其中高劑量組（2.000 mg/kg）顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；對(duì)照藥物左氧氟沙星高、中、低3個(gè)劑量組腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)值與對(duì)照組相比，分別下降了3.00、2.24、1.29，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05）。受試藥物與同劑量的左氧氟沙星相比，2.000 mg/kg劑量組的腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)無顯著差異（P＞0.05），0.500和0.125 mg/kg劑量組腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)顯著高于同劑量的左氧氟沙星（P＜0.05），表明在較高劑量下，馬泡瓜多糖提取物與左氧氟沙星治療泌尿道感染小鼠方面有相似療效。

表2 大腸桿菌泌尿道感染的療效測(cè)定結(jié)果（腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)，n=10）

表3 大腸桿菌泌尿道感染的療效測(cè)定結(jié)果（腎剖面蓋印，n=10）

腎剖面蓋印結(jié)果同樣顯示，與對(duì)照組相比，受試藥物2.000 mg/kg、0.500 mg/kg劑量組均有顯著療效（P＜0.01或P＜0.05），對(duì)照藥物左氧氟沙星2.000 mg/kg、0.500 mg/kg、0.125 mg/kg劑量組均有顯著療效（P＜0.01）。受試藥物與同劑量的左氧氟沙星相比，2.000 mg/kg、0.500 mg/kg劑量組的腎剖面蓋印結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），0.125 mg/kg劑量組腎剖面蓋印結(jié)果顯著低于同劑量的左氧氟沙星（P＜0.05）。

3 結(jié)論

馬泡瓜多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抗菌活性且劑量越高，活性越高；2.000 mg/L馬泡瓜多糖對(duì)小鼠上行實(shí)驗(yàn)性泌尿道感染有較好療效，腎組織勻漿菌落計(jì)數(shù)和腎剖面蓋印結(jié)果與同劑量左氧氟沙星比較無差異，有相似的體內(nèi)療效。