李 慧，鄒晨鑫，李 鉑，姜 祎，高 靜，顏永剛，張 崗，宋小妹，楊新杰

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712046)

珠子參PanacisMajorisRhizoma(PMR)系五加科植物珠子參[PanaxjaponicusC. A. Mey. var. major (Burk.) C. Y. Wu et Feng ex C. C how]的干燥根莖，主要分布于我國陜西、四川、云南、甘肅、貴州等地。味苦、甘，性微寒，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰，祛瘀止痛，止血的功效，主治氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)痹痛、咳血、吐血、崩漏、外傷出血等[1]。藥用歷史悠久，為太白七藥之一。現(xiàn)代化學(xué)研究表明珠子參主要含有皂苷、多糖、揮發(fā)油和多種微量元素等成分，其特征性成分主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳa、人參皂苷Ro、Rc、Re、Rf、三七皂苷R2、珠子參皂苷R1等三萜皂苷類化合物[2]。藥理研究表明珠子參有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、增強(qiáng)免疫功能[6]以及促進(jìn)骨髓造血功能[6]等藥理活性。

光是植物生存和生長發(fā)育不可或缺的條件之一，它調(diào)控著植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。眾多相關(guān)研究報(bào)道表明，光對(duì)藥材的生長及其有效成分的積累有顯著影響，可以通過調(diào)控光照條件的手段來提高藥材產(chǎn)量及有效成分含量。同工酶為催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶的分子類型，是生物機(jī)體中的天然標(biāo)記，可反映出機(jī)體里的各種變化，在植物生長發(fā)育過程中普遍存在同工酶的階段特異性，其酶譜表現(xiàn)與生長發(fā)育階段密切相關(guān)，且不同同工酶種類其特異性不同[7]，可作為研究生理和代謝產(chǎn)物變化的指標(biāo)。珠子參生長緩慢，成藥周期較長，多生于蔭蔽濕潤的環(huán)境[8]，可見其對(duì)光照溫度有一定的要求，關(guān)于不同光照條件對(duì)珠子參皂苷類次生代謝產(chǎn)物積累及同工酶表達(dá)筆者還未見研究，因此用光照調(diào)控試驗(yàn)，以揭示珠子參中不同同工酶與次生代謝產(chǎn)物積累的相關(guān)性，掌握珠子參的生長發(fā)育規(guī)律，探討不同光照對(duì)珠子參生長以及皂苷類次生代謝產(chǎn)物積累的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

珠子參材料來自陜西太白山珠子參種植基地，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為五加科植物珠子參[PanaxjaponicusC. A. Meg var. major (Burk.) C. Y. Wu et Feng]的幼苗。對(duì)照品人參皂苷Ro(批號(hào) 111903-201805)和人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-201933)均購于中國食品藥品檢定研究院，竹節(jié)參皂苷Ⅳa(批號(hào)B21676)購于上海源葉公司。丙烯酰胺(天津天力化學(xué)試劑有限公司)、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨均為(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、Tris(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)、溴酚藍(lán)(上海季藍(lán)生物有限公司)，TEMED(德國sigma公司)，水為去離子水。有機(jī)質(zhì)購買德國大漢植物營養(yǎng)泥炭土栽培介質(zhì)，內(nèi)含全氮4.4%、有機(jī)質(zhì)94.3%、PH值5.6、水分38.1%、電導(dǎo)度值0.2 dS/m。

1.2 儀器

MGC-300H 人工氣候箱(上海一恒科學(xué)有限公司)，Waters 2695 高效液相色譜儀，BIO-RAD 電泳儀及BIO-RAD mini 垂直電泳槽(美國伯樂公司)，GB204 型電子分析天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-200KED 超聲波清洗機(jī) (江蘇昆山超聲波儀器有限公司)；GZX- 9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

2 方 法

2.1 珠子參幼苗培養(yǎng)與處理

將珠子參幼苗移栽于花盆內(nèi)，內(nèi)置栽培基質(zhì)，用自來水充分浸潤后置于溫室大棚同等條件下培養(yǎng)14 d后選取長勢(shì)一致的健康幼苗300株供試驗(yàn)所用，供試材料放置人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)適應(yīng)一周后開始光照處理。在溫度25℃，濕度為70%，光周期12 h/12 h下，設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組(氣候箱光照范圍0～20 000 lx)，分別為強(qiáng)光組16 000 lx、對(duì)照組8 000 lx(飽和光)、弱光組4 000 lx，每組100株珠子參幼苗，連續(xù)處理27 d。分別于第1、3、5、8、13、21、27 d上午9時(shí)隨機(jī)取樣10株作為待測(cè)樣品，共取7次，去除泥沙洗凈濾紙吸干水分，一部分存放于-80℃冰箱保存用于同工酶測(cè)定，另一部分于50℃烘干，用于有效成分含量的測(cè)定，每組處理三次重復(fù)。

2.2 生長指標(biāo)的測(cè)定

分別于第1、3、5、8、13、21、27 d隨機(jī)選取10株珠子參，測(cè)定珠子參生物量(干重)。

2.3 皂苷類成分HPLC分析

HPLC測(cè)定分析參考文[9]的方法優(yōu)化。珠子參根莖烘干，稱重，粉碎，取0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重。超聲處理40 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放至室溫，補(bǔ)足失量，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。精密稱取各對(duì)照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用適量色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成含人參皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人參皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，進(jìn)0.22 μm微孔濾膜濾過即。得色譜條件為：色譜柱為Thermo C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.02%磷酸水(B)，梯度洗脫：0～10 min(5%～40% A)；10～22 min(40%～75% A)；22～34 min(75%～90% A)，檢測(cè)波長203 nm，柱溫30℃，體積流量1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

圖1 供試品溶液(A)和混合對(duì)照品(B)的HPLC色譜圖Fig. 1 Sample (A) and HPLC of mixed reference substances(B)注: 1-人參皂苷Rg1；2-人參皂苷Ro；3-竹節(jié)參皂苷Ⅳa

2.4 CAT、SOD、POD同工酶譜分析

同工酶主要測(cè)量CAT、SOD、POD抗氧化酶活性。方法參考文獻(xiàn)[10-12]加以改進(jìn)。CAT同工酶用鐵染色法，SOD同工酶用氮藍(lán)四唑法，POD同工酶用聯(lián)苯胺法。取0.1 g根莖，液氮研磨，加入10 mmol/L Tris-HCl PH 7.4緩沖液，料液比1∶10，浸提24 h，10000 rpm離心10 min，取上清液，加入等量40%蔗糖溶液于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用聚丙烯酰胺凝膠垂直版電泳系統(tǒng)分析。SOD和POD采用濃度為10%分離膠，CAT為7.5%分離膠，濃縮膠均為3%的分離度，Tris-Gly(PH 8.3)作為電泳緩沖液，上樣量為20 μl，電泳在冰上進(jìn)行，濃縮膠電流15 mA，溴酚藍(lán)指示劑通過分離膠改為20 mA，電泳至含40%蔗糖溶液的溴酚藍(lán)指示劑遷移至距膠板1 cm時(shí)停止電泳。采用Quantity One軟件(版本4.6.9)計(jì)算凝膠中譜帶，根據(jù)CAT、SOD、POD同工酶譜帶推斷出相應(yīng)的凝膠背景強(qiáng)度，對(duì)圖像定量分析得到的特定的同工酶譜帶進(jìn)行了簡單的數(shù)值表示。

2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(Least significant difference,LSD法)進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同光照條件對(duì)珠子參生物量(干重)的影響

不同光照條件對(duì)珠子參干重的影響見表1，弱光(4 000 lx)下珠子參干重最大，對(duì)照組和兩個(gè)處理組都在前21 d緩慢增加，在第21 d干重達(dá)到最大，第21 d又開始減少，對(duì)照組干重均值與弱光組相差無幾，強(qiáng)光組在前期生長速度低于對(duì)照組與弱光組，均值也低于強(qiáng)光組，可見強(qiáng)光抑制珠子參生長。

3.2 不同光照處理對(duì)珠子參幼苗皂苷類成分積累的影響

不同光照處理對(duì)珠子參幼苗中皂苷類成分積累的影響如圖2所示。弱光照處理對(duì)人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的積累起促進(jìn)作用，而強(qiáng)光照處理抑制其含量增加。不同光照強(qiáng)度處理后，強(qiáng)光組處理第5 d三種皂苷成分含量達(dá)到最高值，弱光組、對(duì)照組第3 d三種皂苷成分含量達(dá)到最高值，后續(xù)20多天處于下降模式，含量值有上下波動(dòng)。不同光照處理的影響依次為4 000 lx>8 000 lx>16 000 lx，3種有效成分含量都呈“M”型或“N”型波動(dòng)。方差分析表明，珠子參皂苷類成分在各處理下均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。

表1 不同光照條件對(duì)珠子參干重的影響Table 1 Effects of different light conditions on the dry weight of PMR(g，n=10)

圖2 不同光照條件下珠子參3種有效成分含量的影響Fig. 2 Effects of different light conditions on the content of three active constituents of PMR

3.3 不同光照處理對(duì)珠子參CAT、SOD、POD同工酶的影響

由圖3、4可知在不同光照條件下珠子參CAT、SOD、POD分別有1，2，3條譜帶表達(dá)；CAT譜帶都集中在上部，相對(duì)遷移率(Relative migration,Rf)約為0.18，酶帶頻率為100%，SOD酶帶都集中在中下部，Rf約為0.6的酶帶出現(xiàn)的頻率最高，Rf 0.53的次之，POD酶譜顯示3條酶帶都集中在上部與下部，Rf值分別為0.01、0.18、0.85。與對(duì)照組相比，弱光組珠子參根莖中的CAT活性顯著降低(P<0.05)，SOD活性變化不明顯，POD的活性增強(qiáng)，隨著時(shí)間增長，CAT活性變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，SOD活性變化呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，POD活性變化呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)；強(qiáng)光組珠子參根莖中的CAT活性變化不明顯，SOD活性和POD活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，且隨著時(shí)間的增長，CAT活性變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，SOD活性變化呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，POD活性變化呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。

圖3 不同光照條件下珠子參同工酶譜圖Fig. 3 Three isozyme profiles of PMR under different light conditions注：1、3、5、8、13、21、27分別代表不同樣品處理時(shí)間。

圖4 不同光照處理對(duì)珠子參CAT、SOD、POD同工酶的影響Fig. 4 Effects of different light treatments on CAT, SOD and POD isoenzymes of PMR

3.4 珠子參活性成分積累與CAT、SOD、POD同工酶相關(guān)性分析

珠子參活性成分積累與生態(tài)因子和同工酶表達(dá)之間關(guān)系密切，存在一定相關(guān)性，但許多因素之間的相關(guān)性并不明確。為了明確因素之間的相關(guān)性以及為了進(jìn)一步探討不同光照條件下珠子參的調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)3種皂苷類有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶進(jìn)行簡單相關(guān)性分析，結(jié)果見表2，3，4。

表2 對(duì)照組珠子參有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of the content of active ingredientsof PMR with CAT、SOD and POD isoenzymes in the control group

表3 強(qiáng)光組珠子參有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the content of active ingredients ofPMR with CAT、SOD and POD isoenzymes in the strong light group

表4 弱光組珠子參有效成分含量與CAT、SOD、POD同工酶相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of the content of active ingredientsof PMR with CAT、SOD and POD isoenzymes in the low light group

對(duì)照組中SOD與人參皂苷Ro和CAT呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，強(qiáng)光下有效成分含量與同工酶無顯著性相關(guān)，弱光下竹節(jié)參皂苷Ⅳa與CAT呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，從以上結(jié)果可知化學(xué)成分含量越高與SOD、CAT活性相關(guān)性越顯著，其中CAT與有效成分含量較高的人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa最為顯著，這表明在植物受到脅迫時(shí)CAT比SOD、POD在促進(jìn)含量較高的有效成分合成時(shí)參與度高。

4 討 論

植物在長期的進(jìn)化過程中因生長于不同的光照強(qiáng)度下，會(huì)形成喜陰或喜陽的特性，對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)也會(huì)因植物的不同而產(chǎn)生不同結(jié)果。珠子參作為秦巴山區(qū)特色秦藥之一，隨著市場(chǎng)需求的不斷增加，解決珠子參人工栽培過程中的關(guān)鍵技術(shù)問題迫在眉睫。人工氣候箱是目前藥用植物受控試驗(yàn)的常用技術(shù)手段之一，能夠最大化確定一個(gè)既能促進(jìn)次生代謝又不影響生物量積累的脅迫閾值、最佳脅迫周期，從而為之后中藥材規(guī)范化種植過程中提供參考[13]。通過設(shè)置不同的光照強(qiáng)度來闡明不同光照條件對(duì)珠子參生長，有效成分以及同工酶的影響。結(jié)果表明16 000 lx，4 000 lx，8 000 lx的光照強(qiáng)度對(duì)珠子參干重具有不同程度的影響，其中弱光的光照強(qiáng)度下珠子參干重積累最大，強(qiáng)光積累最小，強(qiáng)光組干重均值低于弱光組與對(duì)照組，三組前期都緩慢增長在第21 d達(dá)到最大后便開始下降，強(qiáng)光組生長最為緩慢，說明過度光強(qiáng)對(duì)珠子參產(chǎn)生嚴(yán)重迫害，強(qiáng)光抑制珠子參生長。

植物的次生代謝物是長期進(jìn)化以及由于環(huán)境影響而得到產(chǎn)物，它有著提高植物自身保護(hù)能力，增強(qiáng)生存競(jìng)爭能力以及協(xié)調(diào)與環(huán)境關(guān)系等方面的重要作用[14]，與初生代謝產(chǎn)物相比在產(chǎn)生和變化方面更易受外界影響。試驗(yàn)結(jié)果表明不同光照條件對(duì)珠子參3種有效成分含量積累的影響都具有顯著性影響，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa，3種有效成分在弱光下含量積累最高且差異顯著，強(qiáng)光下有效成分含量積累最低。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)在溫室中隨著透光率的增加，使人參根中的人參皂苷含量不斷增加，而且人參葉總皂苷中的原人參三醇系皂苷含量高于原人參二醇系人參皂苷含量[15]；植物體內(nèi)存在不同的同工酶，不同處理過后會(huì)產(chǎn)生酶系統(tǒng)的差異。當(dāng)植物在光飽和點(diǎn)以下時(shí)它所需的光能未達(dá)到飽和不會(huì)對(duì)植物造成傷害，當(dāng)光照過強(qiáng)時(shí)會(huì)激發(fā)活性氧的增加進(jìn)而破壞植物的抗氧化系統(tǒng)。在本實(shí)驗(yàn)中CAT、SOD、POD均在強(qiáng)光組下條帶表達(dá)最強(qiáng)，而珠子參有效成分含量最低，這說明光照強(qiáng)度過大，使得珠子參吸收光能過剩，產(chǎn)生氧自由基，使CAT、SOD、POD活性增高去分解細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞防止受到活性氧的傷害。同工酶等的表達(dá)調(diào)控了珠子參皂苷類活性成分體內(nèi)合成，而光照條件作為外部因素對(duì)皂苷類成分的合成也有著重要的影響，但目前尚未明確皂苷類活性成分代謝途徑究竟如何進(jìn)行，同工酶的表達(dá)相互影響，協(xié)同增減，在珠子參根組織中表現(xiàn)出了一定的相關(guān)性。通過對(duì)珠子參有效成分與同工酶相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光下有效成分含量與同工酶無顯著性相關(guān)，弱光下竹節(jié)參皂苷Ⅳa與CAT呈顯著負(fù)相關(guān)，說明竹節(jié)參皂苷Ⅳa與過氧化氫酶存在某種關(guān)聯(lián)。這可能是不同光照強(qiáng)度使珠子參CAT酶與竹節(jié)參皂苷Ⅳa發(fā)生反應(yīng)，推測(cè)可能與化合物羥基有關(guān)[16]，說明在不同光照條件下CAT同工酶參與調(diào)控了皂苷類活性成分的積累。

通過對(duì)珠子參不同光照條件脅迫，高效液相色譜法分析其成分變化，同工酶分析酶帶活性，為珠子參后續(xù)的質(zhì)量控制，資源合理利用提供了科學(xué)依據(jù)。為了進(jìn)一步闡明珠子參皂苷類次生代謝產(chǎn)物積累的過程，接下來可進(jìn)一步探討不同光照條件對(duì)珠子參根莖中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響。