史東杰，李文通，姜巨峰，王賽賽，朱 華*，張 欣

(1.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所暨國家淡水漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，北京 100068；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點試驗室，北京 100097；3.漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點試驗室，北京 100097；4.天津市水產(chǎn)研究所暨天津市觀賞魚技術(shù)工程中心，天津 300221)

自20世紀90年代初，錦鯉養(yǎng)殖業(yè)成為我國漁業(yè)的重要經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)。錦鯉(CyprinuscarpioL.)屬大型觀賞魚類，以體格健美、色彩艷麗、泳姿優(yōu)雅被譽為“水中活寶石”“會游泳的藝術(shù)品”。錦鯉主要從體型、體色、斑紋和游姿等多個指標進行鑒賞，在其他鑒賞指標相同的條件下，體型較大者則價值更高。此外，錦鯉鑒賞另外一方面主要體現(xiàn)在體色、斑紋等體表特征，但頻繁發(fā)生的病害導(dǎo)致體表受損，產(chǎn)生的疤痕嚴重降低了錦鯉的觀賞性，對錦鯉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了較大的威脅。因此，尋找有效的生態(tài)預(yù)防措施，特別是能夠增強錦鯉機體免疫力的內(nèi)源性益生菌，就成為控制錦鯉病害發(fā)生的最有前景的方法之一。

錦鯉生活的水環(huán)境中存在著種類繁多、數(shù)量龐大的細菌群落。養(yǎng)殖水體中的細菌通過錦鯉攝食、呼吸等行為進入體內(nèi)，不同種類和數(shù)量的細菌在錦鯉體內(nèi)組織、器官內(nèi)形成了一個復(fù)雜、動態(tài)的微生物系統(tǒng)。以消化道為例，一方面消化道內(nèi)有益菌可調(diào)節(jié)腸道菌群，復(fù)合益生菌可使草魚(Ctenopharyngodonidellus)[1]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[3]腸道中有益菌數(shù)量增加，有害菌數(shù)量降低，可改善和平衡腸道菌群，促進個體發(fā)育；另一方面可抑制有害微生物生長，增強對致病菌的抵抗力[4]。同時，益生菌產(chǎn)生的細菌素具有廣譜抑菌作用[5]。目前，在漁業(yè)養(yǎng)殖中應(yīng)用的益生菌種類較多，其研究主要集中于對水質(zhì)和組織器官的表觀調(diào)節(jié)作用，而對魚類生長和相關(guān)免疫基因表達的影響研究報道尚少。

本課題組前期研究表明，復(fù)合益生菌(枯草芽孢桿菌∶丁酸梭菌∶糞腸球菌=1∶1∶5)可使錦鯉親魚繁殖性能和仔魚成活率顯著提高。以益生菌為主要成分的微生態(tài)制劑可使錦鯉獲得最優(yōu)的生長性能，并具備良好的免疫力[6]。然而，在錦鯉幼魚階段，其益生菌的需求量對機體生長和免疫能力的響應(yīng)是否與親魚一致呢？本研究選用初始體重為248.13 ± 4.71 g錦鯉幼魚，就益生菌對其生長性能和相關(guān)免疫基因表達進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚 試驗用魚來自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所小湯山良種繁育中心自行培育的紅白錦鯉幼魚400尾，初始體質(zhì)量為147.22±4.51 g。試驗魚暫養(yǎng)于小型循環(huán)水養(yǎng)殖池(3.2 m×1.8 m×1.5 m)中，水深1.2 m。養(yǎng)殖水溫為24±2℃，pH 7.4～7.8，溶解氧5 mg/L。每日投喂2次(9:30～10:00、17:00～17:30)，日投喂量為魚體重的2%～3%，根據(jù)魚體的攝食、水溫和天氣變化情況等做適當調(diào)整。試驗暫養(yǎng)7 d，正式試驗期60 d。

1.1.2 益生菌 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)由漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點試驗室從健康錦鯉消化道中分離得到，純化后進行發(fā)酵培養(yǎng)，并收集菌體，測定菌液濃度，活菌量分別達到了109CFU/mL?？莶菅挎邨U菌、丁酸梭菌和糞腸球菌按照一定比例分別進行單一菌種和復(fù)合菌種添加到飼料中，復(fù)合菌數(shù)比例按1∶1∶5進行復(fù)配，因3種菌的活菌量一致，將菌數(shù)比轉(zhuǎn)化為體積比進行復(fù)配，復(fù)配后活菌量仍為109CFU/mL。

1.1.3 飼料制備 基礎(chǔ)飼料購于北京三友創(chuàng)美飼料科技有限公司，營養(yǎng)成份為粗蛋白38.2%、粗脂肪22.3%、粗灰分11.4%、水份3.5%。免疫飼料：取1.1中單一菌種和復(fù)配菌液以活菌數(shù)(CFU)/飼料重(mg)分別噴灑到基礎(chǔ)飼料中，陰干，使飼料中含菌總量達到109CFU/mg，從而制得枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌和復(fù)合菌落數(shù)比例為1∶1∶5的4種益生菌飼料。菌液和飼料于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。? d涂平板計數(shù)，檢測免疫飼料中益生菌含量在試驗期間是否達到要求(菌含量達到109CFU/mg視為合格)。

1.1.4 主要試劑 總RNA提取試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TransScript Green qPCR Super MIX試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 平板計數(shù)器(Vi-CELL XR)，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司產(chǎn)品；超低溫冰箱(DW-86L288)，海爾集團產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYCP-31BN)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(MA-6000)，蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司；TransScript Green qPCR Super MIX試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 錦鯉幼魚暫養(yǎng)7 d后，隨機挑取個體均勻、健康無病的300尾分配到15個網(wǎng)箱(1 m×1 m×1 m)中，共5組，每組3個平行，每個平行20尾。對照組為A組，投喂試驗基礎(chǔ)飼料。取1.2中4種復(fù)配菌液以活菌數(shù)(CFU)/飼料重(mg)分別噴灑到飼料中，晾干，使飼料中含菌最終濃度為109CFU/mg，從而制得復(fù)合益生菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌的四種含有益生菌的飼料，分為B、C、D、E 4個試驗組。所有組別按照暫養(yǎng)條件管理。

1.2.2 生長指標分析 于試驗開始前和養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，禁食24 h，分別稱取對照組和試驗組錦鯉幼魚的體質(zhì)量，并記錄試驗期間各組錦鯉幼魚的成活率、飼料投喂情況。選用增重率、特定生長率、飼料系數(shù)、成活率作為主要生長性能指標，具體計算方法如下：

增重率(WGR，%)=(終末體重-初始體重)/初始體重×100；

特定生長率(SGR，%/d)=(ln終末魚體重-ln初始魚體重)/飼養(yǎng)天數(shù)×100；

飼料系數(shù)(FCR)=總投喂量/(終末體重+死魚重量-初始體重)；

成活率(SR，%)=試驗?zāi)~尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù)×100。

1.2.3 免疫相關(guān)基因的表達量分析

1.2.3.1 樣品總RNA提取和cDNA合成 養(yǎng)殖試驗60 d后，隨機選擇8尾作為樣本采集魚，先用濃度為0.1 g/L的MS-222麻醉后，采用常規(guī)方法尾靜脈取血，放入RNase-Free的1.5 mL EP管內(nèi)，于液氮速凍后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。解剖出?nèi)臟，于肝臟、腸道迅速取一小塊用錫箔紙包好后速凍，保存方法同尾靜脈血。采用Trizol 法分別提取血液和各組織的總RNA，用Nandrop 2000c 定量檢測總RNA的濃度和質(zhì)量，20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，放入-80℃冰箱中備用。應(yīng)用試劑盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix進行錦鯉幼魚血液和各組織的cDNA第一條鏈的合成。

1.2.3.2 實時熒光定量PCR分析基因表達 錦鯉幼魚免疫相關(guān)基因，內(nèi)參基因β-actin正向和反向引物序列見表1，使用的引物序列參考文獻[7]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。實時熒光定量PCR按照試劑盒TransScript Green qPCR Super MIX說明書，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s進行預(yù)變性；95℃ 10 s、60℃退火延伸20 s，45個循環(huán)；反應(yīng)后72℃上升至95℃，每升高1℃采集信號，測定熔解曲線檢測反應(yīng)的特異性。4種基因表達結(jié)果采用2-△△Ct法進行計算。

表1 錦鯉幼魚免疫相關(guān)基因與內(nèi)參基因β-actin引物序列

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差(means±SD)表示。采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，做單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異顯著，用Duncan分析進行多重比較，顯著差異水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 益生菌對錦鯉幼魚生長性能的影響

表2顯示，單一菌種和復(fù)合菌種的益生菌對錦鯉幼魚的生長均有促進作用。與對照組A組相比，各益生菌添加組的WGR、SGR均顯著增加(P<0.05)，其中復(fù)合益生菌添加組B組WGR最高為38.13%，其次為添加枯草芽孢桿菌組C組為34.66%，B組SGR較對照組提高25.58%。但添加丁酸梭菌組D組FCR與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，其他添加組則顯著降低(P<0.05)。不同添加組對成活率無顯著影響(P>0.05)。

表2 益生菌對錦鯉幼魚生長性能的影響

2.2 益生菌對錦鯉幼魚免疫相關(guān)基因的表達量的影響

表3顯示，飼料中添加單一菌種和復(fù)合菌種的益生菌對錦鯉幼魚血液中proPO mRNA相對表達量受影響明顯，在B組復(fù)合益生菌添加組較對照組升高3倍之多(P<0.05)，而C組、D組雖然較對照組相比有所增加，但未產(chǎn)生顯著變化(P>0.05)。各試驗組添加益生菌投喂后，錦鯉幼魚血液中LZM mRNA相對表達量發(fā)生顯著變化(P<0.05)。與對照組相比，B組復(fù)合益生菌添加組升高2倍之多(P<0.05)。與對照組相比，益生菌投喂組錦鯉幼魚腸道中GST mRNA相對表達量有所升高，B組復(fù)合益生菌添加組升高了32.45%(P<0.05)，而E組糞腸球菌升高了3.45%，差異未達到顯著水平(P>0.05)。飼料中添加益生菌后，錦鯉幼魚肝臟中Hepc mRNA相對表達量發(fā)生顯著變化(P<0.05)，復(fù)合益生菌添加組B組較對照組升高了76.82%(P<0.05)，其他試驗組也呈顯現(xiàn)顯著升高(P<0.05)。

表3 益生菌對錦鯉幼魚免疫相關(guān)基因的表達量的影響

3 討論

3.1 飼料中添加益生菌促進錦鯉幼魚的生長

本試驗所采用的枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和糞腸球菌由本試驗室自行生產(chǎn)，這些作為益生菌使用的物質(zhì)屬于非致病菌。當該物質(zhì)混合或者單一添加到飼料中投喂錦鯉幼魚60 d，其促生長作用主要是通過增重和飼料利用來體現(xiàn)。在本研究中，單一菌種和復(fù)合菌種的益生菌對錦鯉幼魚的生長都具有促進作用。與對照組相比，各益生菌添加組增重率和特定生長率顯著增加，而飼料系數(shù)明顯降低。說明益生菌對錦鯉幼魚的促生長作用主要通過增加體重，降低飼料系數(shù)來體現(xiàn)。樊英等對凡納濱對蝦(Cyprinuscarpio)[7]、徐晨等對異育銀鯽(Carassiusauratus)[8]、劉淑蘭對大西洋鮭(Salmosalar)[9]的研究均得出類似結(jié)論。這可能是由于：①益生菌具有增強腸道蛋白質(zhì)消化酶活性作用，可促進機體對外源營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而增強了錦鯉的食欲；②益生菌具有調(diào)節(jié)腸道和機體微生態(tài)平衡的功能，從而提高免疫力，增強機體代謝水平；③益生菌具有抗氧化、抗炎等多種生物活動功能，減輕應(yīng)激反應(yīng)，保持機體處于健康狀態(tài)，從而促進生長。在已有的研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌的添加比單一益生菌更能促進水產(chǎn)動物生長[10]。如在本試驗中，復(fù)合益生菌對錦鯉幼魚的生長性能最佳，其主要由枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌按照1∶1∶5進行復(fù)配而來。而就生長性能而言，促生長功能排序為：復(fù)合益生菌>枯草芽孢桿菌>糞腸球菌>丁酸梭菌。綜合復(fù)合益生菌的配比和試驗結(jié)果來看，糞腸球菌在復(fù)合益生菌中的配比較高，但單一使用糞腸球菌投喂錦鯉幼魚的促生長作用卻弱于單一枯草芽孢桿菌飼料添加組。劉翠玲[11]用糞腸球菌(600 mg/kg)、枯草芽孢桿菌(300 mg/kg)分別飼喂鯉魚幼魚(12.54 g±0.03 g)8周，發(fā)現(xiàn)兩種添加劑對鯉魚幼魚的生長和消化均具有顯著的促進作用，且枯草芽孢桿菌添加劑的促進作用優(yōu)于糞腸球菌，該研究結(jié)果與本研究一致。但還應(yīng)補充環(huán)境條件、菌種協(xié)同互補及錦鯉幼魚促生長代謝機理方面的研究。益生菌的種類繁多，對水生動物生長的促進作用也具有不同的效果[7-11]，本研究與已有的研究相比也證實了此觀點。

3.2 飼料中添加益生菌增強錦鯉幼魚免疫功能

通過本文的投喂試驗證實，枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和糞腸球菌單一菌種或復(fù)合菌種添加到飼料中，可以不同程度的提高proPO、LZM、GST和Hepc免疫基因的表達。投喂復(fù)合菌種的試驗組更是顯著提高了錦鯉幼魚相關(guān)免疫基因的表達，說明復(fù)合益生菌的投喂為錦鯉幼魚提供了更強的免疫刺激。原因可能是活菌能在魚體血液、腸道和肝臟定殖，并能刺激非特異性免疫系統(tǒng)，從而提高機體免疫力，這一研究結(jié)果與Vazirzadeh A對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究結(jié)果一致[12]。酚氧化酶原(proPO 系統(tǒng))是魚類體液免疫特異性因子之一，可產(chǎn)生活性酚氧化酶(phenoloxidase,PO)，參與機體防御功能，可在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。溶菌酶(lysozyme,LZM)廣泛分布在魚體內(nèi)，可破壞革蘭氏陽性菌細胞壁成份，從而促使機體能夠抵御病原微生物入侵。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是魚類重要Ⅱ相去毒酶之一，在催化外源毒素與還原谷胱甘肽(GSH)去毒代謝等過程中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。魚類抗菌肽(hepcidin)是一類含有Cys的抗菌肽，具有廣譜抗菌作用，在魚類肝臟中表達量最高。眾多學(xué)者推測，魚類hepcidin可能在抵抗病原微生物防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外研究結(jié)果顯示，何偉聰?shù)萚13]在軍曹魚幼魚基礎(chǔ)飼料中添加枯草芽孢桿菌進行投喂試驗，其血清LZM表達量顯著上調(diào)；楊虎城[14]報道了用含有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)和糞腸球菌的試驗飼料投喂羅非魚40d，結(jié)果顯示免疫相關(guān)基因均顯著表達。孫艷等[15]報道了用含有芽孢桿菌(Bacillus)/溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的飼料投喂凡納濱對蝦，可顯著提高血淋巴細胞中proPO、SOD和LZM的相對表達量，并表明飼料中添加芽孢桿菌和溶藻弧菌復(fù)合益生菌使用更能提高對蝦抗SSV感染能力。Chiu C H等[16]報道了乳酸菌作為益生菌添加到飼料中，可顯著提高凡納濱對蝦proPO 6.1倍。Lui K F等[17]報道了在對蝦(Penaeuschinensis)幼體養(yǎng)殖用水中添加一定量的枯草芽孢桿菌，可顯著提高活性酚氧化酶的表達量。這些研究報道與本文用枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和糞腸球菌單一/復(fù)合益生菌投喂后可顯著提高錦鯉幼魚相關(guān)免疫基因表達量結(jié)果一致。本研究選擇的4種免疫基因都是參與魚類非特異性免疫反應(yīng)的主要蛋白，結(jié)合4種基因的相對表達量結(jié)果分析，表明外源益生菌的補充，能夠顯著提高錦鯉幼魚免疫因子的表達量。

綜上所述，在飼料中添加單一/復(fù)合益生菌，均可有效提高錦鯉幼魚的生長性能，以復(fù)合益生菌使用效果更好，且proPO、LZM、GST和Hepc免疫基因相對表達量在不同程度上均高于對照組，可見枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和糞腸球菌可以作為益生菌應(yīng)用于錦鯉養(yǎng)殖。