雷 磊，牟 婧，關桐旭，金圣子，李婉瑩，劉 云

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院/黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱150030)

伊曲康唑(itraconazole,ITZ)是一種具有廣譜抗真菌活性的三唑類抗真菌藥，被廣泛應用于淺表及系統(tǒng)真菌感染的治療。在獸醫(yī)臨床上，ITZ被用來治療多種動物皮膚癬菌病、念珠菌病、馬拉色菌病、隱球菌病、組織漿胞菌病[1]、曲霉菌病、芽生菌病和其他真菌感染，療效顯著。ITZ通過與真菌CYP底物結合位點相互作用，阻斷羊毛甾醇14α-去甲基化，導致羊毛甾醇和其他14α-甲基甾醇在細胞膜上積累，真菌細胞膜的滲透性、膜結合酶活性和幾丁質合成異常，最終真菌細胞死亡[2]。ITZ是一種弱堿性藥物，水溶性極差，只能酸性條件下發(fā)生電離，這對劑型的開發(fā)和應用帶來了不少的困難。其血漿蛋白結合率高達99%以上，具有親脂性和親角質性，相較于血漿，皮膚角質層、毛發(fā)、皮脂和組織器官中ITZ濃度更高，局部的高濃度藥物更有利于皮膚淺表和肺部真菌感染的治療。

羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)是一種淀粉經浸麻芽孢桿菌和其他細菌代謝的副產物,其分子具有內部疏水、外部親水性的“筒狀結構”；由于這種特殊結構和良好的安全性，許多藥物制劑使用HP-β-CD作為藥物搭載系統(tǒng)，如糖皮質激素、雌二醇、多肽、蛋白質和其他難溶性藥物；其分子內部產生的脂溶性微環(huán)境，在適當?shù)谋壤?，可以穩(wěn)定搭載ITZ，復合物具有良好的水溶性，很大程度上解決了ITZ吸收度差的問題。

目前國內尚無獸用商品化伊曲康唑制劑，獸醫(yī)臨床應用大多為人用伊曲康唑或由獸醫(yī)師配置的復方伊曲康唑。但人用伊曲康唑成本過高，復方伊曲康唑吸收度極差、生物利用度極低[3-4]，不足以達到目標治療濃度。因此，亟需開發(fā)一種適合獸醫(yī)臨床應用的伊曲康唑制劑。ITZ的給藥方式主要有口服和靜脈注射兩種。但ITZ膠囊吸收不穩(wěn)定，生物利用度低；口服液與膠囊相比，雖然在生物利用度方面有所提升，但兩種口服藥都會受到飲食、胃腸運動和肝腸首過效應的影響，產生較大的個體差異[5-6]；靜脈注射液雖然能在人體內達到良好的血藥濃度和臨床療效，但對于獸醫(yī)臨床來說，成本過高且操作復雜，動物依從性差。皮下注射途徑具有穩(wěn)定的吸收特性、較高的生物利用度，且便于管理，適合獸醫(yī)臨床應用。

本試驗對伊曲康唑環(huán)糊精制劑皮下注射途徑給藥的安全性進行探索，設置3個不同劑量(2.5 mg/kg、7.5 mg/kg和12.5 mg/kg)多次給藥，對犬臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、血液生化、尿常規(guī)等進行評價，為開發(fā)簡單、高效的獸用伊曲康唑制劑提供安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年比格犬32只，體重±10 kg，雄性，未去勢，已免疫驅蟲，由哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院實驗動物中心提供。飼料為全價日糧，不添加任何藥物，自由飲水，飼養(yǎng)于東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院臨床教學醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑 伊曲康唑注射液(10 mg/mL)，四川鼎尖動物藥業(yè)有限責任公司產品。

1.1.3 主要儀器 動物型生化分析儀(D240V型)，南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司產品；全自動血常規(guī)分析儀(MEK-7222K型)，日本光電工業(yè)株式會社公司產品；尿液分析儀(VetLab UA型)，美國IDEXX公司產品。

1.2 方法

1.2.1 劑量與分組 試驗犬建立穩(wěn)定，科學的生活制度。在標準實驗條件下喂養(yǎng)14天適應環(huán)境并評價其健康狀況。將健康犬進行稱重、編號，隨機分為4組，每組8只，體重大致相等。給藥組分別按照2.5 mg/kg、7.5 mg/kg和12.5 mg/kg劑量，背部皮下多點注射，每點不超過0.25 mL，3日1次，連續(xù)注射7次。對照組注射等體積的生理鹽水。于試驗過程中第0、5、10、15、19天進行相關指標的觀察和測定。

1.2.2 臨床觀察 試驗期間觀察動物的體溫、體重、呼吸、行為、排糞、精神狀態(tài)、運動、被毛、皮膚狀態(tài)及飼料消耗量等是否有異常變化。

1.2.3 血常規(guī)檢查 于試驗過程中第0、5、10、15、19天，所有受試犬采血5 mL，使用肝素鈉抗凝管抗凝。采血部位為前肢頭靜脈和后肢隱靜脈，采血速度適當，采樣結束后立刻用全自動血常規(guī)分析儀進行檢查。

檢測的血液學參數(shù)包括：白細胞計數(shù)，淋巴細胞計數(shù)，單核細胞計數(shù)，淋巴細胞百分比，單核細胞百分比；紅細胞計數(shù)，血紅蛋白濃度，平均紅細胞血紅蛋白濃度，紅細胞壓積，平均紅細胞體積，紅細胞分布寬度，平均紅細胞血紅蛋白量；血小板計數(shù)，平均血小板體積，血小板分布寬度和血小板壓積。

1.2.4 血液生化檢查 血常規(guī)檢查后，立即對采集的血液進行離心(3 000 r/min，10 min)，取上層血漿于-20℃保存?zhèn)溆谩?℃融化后，使用動物生化分析儀進行血液生化檢查。

檢查的項目有谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷酰氨轉移酶(GGT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(DBIL)、直接膽紅素(TBIL)、尿素(BUN)和肌酐(Cre)。

1.2.5 尿常規(guī)檢查 于試驗過程中第0、5、10、15、19天，以自然采集和導尿的形式采集部分受試犬的尿液，檢測pH、比重、尿蛋白、尿糖、尿膽紅素和尿酮。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用IBM SPSS Statistics 21，對組內和組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，比較差異性。

2 結果

2.1 臨床觀察

試驗過程中所有受試犬體溫、體重、呼吸、行為、精神、排便及飼料消耗量等無異常變化。中高劑量組部分注射部位腫脹、僵硬、痛疼，但無皮膚損傷和感染。在試驗結束后2周內，該癥狀完全消失。

2.2 血常規(guī)檢查

2.2.1 對紅細胞相關指標的影響 低劑量組犬在第10天和第19天紅細胞計數(shù)出現(xiàn)一過性降低；中劑量組犬在第15天紅細胞壓積輕度降低；高劑量組犬在第19天紅細胞計數(shù)輕度降低。其他紅細胞相關指標無明顯變化。雖然給藥組部分指標輕度變化，但均在正常范圍內，無劑量和時間依賴性，結果見表1。

表1 伊曲康唑注射液對犬紅細胞相關指標的影響

2.2.2 對白細胞相關指標的影響 低劑量組在試驗第5天、第10天和第19天，中劑量組在第5天和第19天，高劑量組在第15天和第19天，白細胞計數(shù)升高，部分指標超出正常范圍，試驗過程中給藥組部分單核細胞指標和淋巴細胞指標均有一定的變化，但無劑量和時間依賴性，且在停藥后第5天相關異常指標均恢復正常。結果見表2。

表2 伊曲康唑注射液對犬白細胞相關指標的影響

2.2.3 對血小板相關指標的影響 低劑量組和高劑量組犬血小板計數(shù)出現(xiàn)一過性升高，中高劑量組犬血小板平均體積出現(xiàn)一過性升高，但均在正常范圍內，其他血小板相關指標無明顯變化，無劑量和時間依賴性。結果見表3。

表3 伊曲康唑注射液對犬血小板相關指標的影響

2.3 血漿生化指標檢查

2.3.1 對肝功能的影響 中高劑量組谷草轉氨酶出現(xiàn)一過性升高或降低，雖然給藥組總膽紅素和直接膽紅素出現(xiàn)較大幅度的變化，但與對照組相比并無明顯異常，無劑量依賴性或時間依賴性，且都在正常生理范圍內，無病理損傷意義。其他相關指標無明顯變化。結果見表4。

表4 伊曲康唑注射液對犬肝功能指標的影響

2.3.2 對腎功能的影響 低高劑量組尿素出現(xiàn)一過性升高或降低，雖然3個給藥組肌酐出現(xiàn)較大幅度的變化，但與對照組相比并無明顯異常，無劑量依賴性或時間依賴性，且都在正常生理范圍內，無病理損傷意義。結果見表5。

表5 伊曲康唑注射液對犬腎功能指標的影響

2.4 尿液檢查

各組犬在試驗過程中尿液顏色正常。3個給藥組尿液pH出現(xiàn)一過性升高或降低，但均在正常范圍內。尿比重無明顯變化，PRO、GLU、BIL、KET呈陰性。結果見表6。

表6 伊曲康唑注射液對犬尿常規(guī)指標的影響

3 討論

目前國內尚無批準使用的ITZ獸用制劑。雖然獸醫(yī)臨床上經常使用ITZ治療犬貓淺表真菌感染，但其應用制劑多為人用膠囊或口服液，無法對其安全性進行統(tǒng)計與分析，在此之前，尚無系統(tǒng)、全面、客觀的評價。

ITZ在肝臟廣泛代謝，肝功能的變化是伊曲康唑毒性的一項重要的評價[7-8]。肝毒性通常定義為AST大于正常上限的3倍，ALP大于正常范圍上限的2倍，或總膽紅素大于正常范圍上限的2倍[9]。具體毒性機制尚不清楚，但通常認為ITZ的肝毒性與長期、持續(xù)使用以及延長脈沖治療有關[10-11]。本實驗對犬進行臨床檢查及肝功能相關生化指標的檢測，雖然給藥組部分指標出現(xiàn)一過性升高或降低，但未發(fā)現(xiàn)這種變化具有劑量依賴性和時間依賴性，且均在正常范圍之內，說明在試驗設置的3個劑量下，犬肝臟具有良好的耐受性。

臨床觀察未發(fā)現(xiàn)犬出現(xiàn)尿液和腎功能相關指標異常，部分輕度的變化均在正常范圍內。雖然有報道稱皮下注射高劑量環(huán)糊精制劑導致試驗鼠腎毒性增加[12]，但在本試驗中并未發(fā)現(xiàn)該變化，這可能與皮下注射劑量有關。臨床常用的環(huán)糊精搭載的皮下注射藥物如雙氯芬酸鈉和孕酮等顯示出良好的安全性和耐受性[13]，也可以說明環(huán)糊精作為皮下注射劑型的增溶劑，在注射劑量較低的情況下具有良好的安全性。普遍認為，ITZ的毒性與血藥濃度有關。一項關于伊曲康唑濃度和毒性關系的研究中，闡明了伊曲康唑的血藥濃度與不良反應的發(fā)生概率密切相關[14]。但這些不良反應的的癥狀都不威脅生命，且在停藥或減少劑量后有所好轉。

盡管該制劑對犬肝腎功能無影響，但在給藥組均發(fā)現(xiàn)白細胞升高現(xiàn)象。在觸診過程中發(fā)現(xiàn)中高劑量組注射部位腫脹、僵硬、疼痛，但未發(fā)生壞死和血液循環(huán)障礙，這種癥狀在試驗結束后兩周內完全消失。剖檢時發(fā)現(xiàn)，該部位皮下組織充血、增生、變硬，但皮膚結構無病理變化。剖檢觀察皮下注射部位無藥物沉淀。低劑量組腫脹程度明顯低于其他兩組，無明顯痛覺。這種現(xiàn)象可能與中高劑量組注射藥物體積過大有關。由于該制劑比較黏稠，其輔料可能不容易吸收，持續(xù)刺激注射部位產生炎癥反應。但在后續(xù)試驗中發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象對ITZ成分的吸收并無影響。在停藥后，腫脹癥狀明顯好轉，未產生不可逆的損傷。

伊曲康唑環(huán)糊精制劑皮下注射具有良好的吸收性，相較于口服制劑，不受食物和pH的影響，避免了肝腸首過效應，減小個體差異，便于達到穩(wěn)定的目標藥物濃度，胃腸耐受性好；與靜脈注射液相比，操作簡單，方便快捷，適合獸醫(yī)臨床應用。但該制劑也存在一定的缺點：①注射部位可能會發(fā)生無菌性炎癥，注射液黏稠，體積相對較大；②在注射過程中，伴隨一定的疼痛。為了解決以上兩個問題，未來的研究中可以考慮開發(fā)更好的伊曲康唑增溶劑，提高藥物濃度，減小注射體積；除此之外，可以考慮在制劑中添加局部麻醉藥，減少注射操作中的痛疼，要注意添加的局麻藥與環(huán)糊精之間的相互作用，確保局麻藥能夠正常發(fā)揮麻醉效果[15]。

總而言之，本試驗對犬伊曲康唑-環(huán)糊精皮下注射液的安全性進行了系統(tǒng)的評價，結果表明該注射液具有良好的耐受性和安全性。相比于口服制劑和靜脈注射液，該劑型具有穩(wěn)定、方便、安全等優(yōu)點，更適合獸醫(yī)臨床使用。由于本實驗動物數(shù)量有限，其安全性和有效性還需在后續(xù)大規(guī)模動物臨床試驗中進行研究和驗證。