劉詩雨，趙夢杉，趙懿侔，郭 帥，萬春云,2，楊豐利,2*

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；2.長江大學教學動物醫(yī)院，湖北荊州 434025)

物質的吸收一般在小腸中進行，而腸上皮包含了腸上皮細胞、內分泌細胞、外分泌細胞、M細胞、杯細胞和叢細胞等等。其中腸上皮細胞占到了80%～90%，承擔了小腸吸收的功能。腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs)是消化道中消化、吸收營養(yǎng)物質，阻止外來抗原、微生物及其毒素通過的主要功能性細胞，包括幾個特化的細胞亞群，它們起源于腸隱窩底部的干細胞，并沿隱窩-絨毛軸分化[1]。通過緊密相連形成了腸道感染的第一道防御屏障。除了作為物理屏障之外，IECs還有助于先天免疫。

中藥主要來源于動物、植物和礦物，其活性成分廣泛分布，主要包括黃酮類、皂苷類、多糖類等，而研究其活性成分在體內發(fā)揮作用的機制有較大的難度[2]。目前，人結腸癌Caco-2細胞系廣泛應用于藥物研究中，關于動物腸上皮細胞內質網應激、炎癥機制，以及真菌毒素、益生菌在動物腸上皮細胞中的作用也已有相關綜述，但是針對動物腸上皮細胞應用于中藥作用機制研究進展未見報道。因此，本論文就動物腸上皮細胞模型的建立及該體外模型應用于中藥的作用機制進行綜述，在中藥作用機制中重點闡述了中藥多酚類、多糖類、生物堿類、皂苷類及中藥方劑在動物腸上皮細胞中的作用機制的研究。

1 動物腸上皮細胞體外模型的建立

腸細胞是研究上皮細胞生長和分化的重要模型。細胞體外模型可用于評估藥物的通過或毒性、腸道致病菌菌株與腸上皮的相互作用，以及涉及消化道的其他生理或病理現象。體外腸屏障的毒理學研究主要基于原代或傳代細胞、永生化腸上皮細胞、非腸源細胞系和共培養(yǎng)物的細胞培養(yǎng)[3]。腸上皮細胞是排列在腸腔內的單層細胞，主要功能包括作為阻止外來有害物質如抗原、微生物及其毒素通過腸腔內的屏障；利用跨上皮細胞轉運途徑和細胞旁路轉運途徑，選擇性通過來自食物中的營養(yǎng)素、電解質和水等物質穿過腸腔進入循環(huán)系統(tǒng)[4]。

為了得到純化的、存活的，具有功能的小腸上皮細胞，許多學者嘗試了各種不同分離方法。目前，人們主要通過組織塊培養(yǎng)法，機械分離法，非酶消化法，蛋白酶水解法4種方法分離獲得具有特定顯形和存活力的上皮細胞[5]。至今，已有人、豬、鼠、家禽、牛、羊、犬、貓和家兔等物種的IECs在體外成功得到了分離培養(yǎng)。當前在研究中廣泛使用的穩(wěn)定動物腸上皮細胞體外模型主要來自于豬和鼠，以下主要闡述豬、鼠腸上皮細胞系的建立。

1.1 豬腸上皮細胞體外模型

豬腸上皮細胞系IPEC-1、IPEC-J2是分離自正常內膜細胞的永生化細胞系，是目前研究中最為常見的腸上皮細胞系，從剛出生的仔豬的腸管中分離培養(yǎng)所得。IPEC-1是一種非轉化的、非癌的、極化的豬小腸上皮細胞，分離自新生仔豬的空腸和回腸。IPEC-J2是一種柱狀上皮細胞系，由新生仔豬的空腸分離所得，屬于非轉化細胞系組[6]。

另一種豬腸道細胞系IPI-2I是從成年野豬的回腸組織中分離出來，通過多重亞克隆形成穩(wěn)定的表皮樣。但IPI-2I的缺點是細胞系分化能力差，表現為缺乏絨毛蛋白表達和跨上皮抗性。此外，還有一種豬小腸上皮細胞系PSI-1[7]。除以上4種細胞系外，國內外學者仍在進行豬腸上皮細胞的分離培養(yǎng)。

BERTERO A等在綜述中提及一種采用組織塊培養(yǎng)法從仔豬近端結腸分離培養(yǎng)獲得原代豬結腸上皮細胞。他們培養(yǎng)的原代豬結腸上皮細胞顯示出與體內極化結腸上皮相似的特征，可作為研究上皮屏障功能的模型[6]。詹康等采用組織塊培養(yǎng)法，從剛出生仔豬小腸組織塊中分離獲得生物學功能穩(wěn)定的豬小腸上皮細胞系并能正常傳11代，可為細胞的永生化提供試驗素材[8]。

1.2 鼠腸上皮細胞體外模型

研究者從大鼠空腸隱窩細胞分離，經體外培養(yǎng)傳代而建立了IEC-6細胞系，它保持了小腸上皮干細胞未分化的特性，在組織學和免疫學方面與增殖性隱窩細胞無明顯差別，且在適當條件下能分化為成熟的腸上皮細胞。IEC-18細胞系是從大鼠回腸隱窩細胞中分離出的，保持了腸隱窩細胞的特性，細胞存活力高，在一定條件下能夠分化成腸上皮細胞。IEC-17細胞從新生大鼠十二指腸分離獲得，與未分化的腸隱窩細胞相似，能表達腸特異性抗原，并且具有少量的微絨毛，但是缺少完全分化的上皮細胞標記物。IRD98是從胎鼠小腸上皮分離得到的細胞系，處于相對分化狀態(tài)，含有氨基肽酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉移酶、糖分解酵素和麥芽糖酶等[9]。

為尋找最適的分離培養(yǎng)小鼠IECs的方法，孫秀梅等分別采用組織塊培養(yǎng)法、嗜熱菌蛋白酶消化法、膠原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ聯(lián)合消化法以及膠原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ聯(lián)合消化法4種方法分離培養(yǎng)IECs，通過細胞免疫組織化學法和細胞免疫熒光法鑒定并比較得出，嗜熱菌蛋白酶消化法及膠原酶Ⅺ與中性蛋白酶Ⅰ聯(lián)合消化法更適合小鼠ICEs的分離和培養(yǎng)[10]。Evans G S等發(fā)現了一種從乳鼠腸中分離原代小腸上皮細胞的方法，允許可重復的定量研究，通過細胞組成和DNA合成的變化確定最佳培養(yǎng)條件[11]。

1.3 其他動物腸上皮細胞體外模型

因牛、羊等大動物在體內研究中耗時費力等缺點，其腸上皮細胞的建立一直是研究的熱點，國內外學者通過不同方法建立了穩(wěn)定的牛、羊腸上皮細胞模型。詹康等從十二指腸、空腸和回腸組織中分離出膽汁反流細胞，并使用膠原酶和脫蛋白酶同時消化和過濾消化液來獲得牛小腸上皮細胞BIEC群，并建立了一種新的克隆細胞方法。研究表明BIEC細胞系可為雙歧桿菌、營養(yǎng)物質的吸收和調節(jié)、免疫屏障以及雙歧桿菌與腸道微生物的關系的研究提供體外模型。

由于寵物醫(yī)療行業(yè)的興起，建立犬貓腸上皮細胞系對研究腸炎型病毒的致病機理及研發(fā)新型寵物疫苗、藥品具有重要意義。Michelle J F建立了用于體外試驗的永生化犬腸上皮細胞系cIECs，cIECs在一定條件下能夠分化成成熟的腸細胞。TLR5和TLR9在犬腸上皮細胞中表達，且犬科動物的腸上皮細胞表面含有MHC Ⅱ分子[12]。Desmarets L M等用膠原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ聯(lián)合消化法，從貓的回腸和結腸中分離培養(yǎng)得到原代回腸細胞和結腸細胞，并驗證了它們在貓冠狀病毒研究中的用途。該細胞模型對不同的腸血清型的Ⅰ型野毒株敏感，貓傳染性腹膜炎病毒在腸上皮細胞中的復制明顯受限[13]。

2 動物腸上皮細胞體外模型用于中藥作用機制的研究

根據歐洲替代方法驗證中心的分類，體內屏障的體外模型分為器官型模型、鼓室、外翻腸囊、分離和灌注腸段和細胞模型。動物細胞模型已被廣泛應用于毒理學研究中，因體外試驗周期短、易于控制試驗條件和因素、方便進行作用機制的實驗設計、避免體內試驗的倫理學問題等優(yōu)點，IECs被廣泛運用于評估藥物的通透性或毒性，以及藥物的體外作用機制[14]。以下主要論述ICEs體外模型在中藥作用機制研究的應用進展。

2.1 藥物作用機制研究的指標

在藥物作用機制的研究中，通過細胞中促炎細胞因子的表達評價藥物的抗炎作用；通過測定TEER量、緊密連接蛋白的基因和蛋白表達等評價腸屏障的完整性和通透性；通過測定細胞中化學標記物，如活性氧、核糖核酸、丙二醛、過氧化氫、超氧化物歧化酶、谷丙轉氨酶、過氧化氫酶和總膽固醇等含量來評價氧化還原反應；通過測定信號通路中特定抗氧化酶的蛋白水平探索藥物作用的信號通路。

TEER是評價腸上皮完整性和通透性的指標，使用電阻系統(tǒng)進行測試。示蹤劑通量反映了單層屏障的完整性和通透性，選用無細胞毒性、無電荷、水溶性、既不被細胞吸收也不被代謝的物質作為標記物，測定物質通過細胞的量[15]。評價腸屏障損傷時，一般采用熒光定量PCR和Western blot法測量緊密連接蛋白基因的轉錄水平和蛋白質表達水平。還可以通過熒光染色觀察 TJ 蛋白的亞細胞定位。此外，還可將藥物與細胞共同孵育一段時間后，測定能夠反應細胞活性的酶量，評價其對細胞活性的影響。通過細胞活性，可測定藥物的半抑制濃度IC50。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)通過腸上皮細胞中的TLR4/NF-κB信號通路誘導腸道功能障礙，觸發(fā)細胞內炎癥反應，并釋放大量促炎因子，TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性細胞因子可誘導細胞凋亡，從而導致炎癥反應。緊密連接(TJ)是腸上皮細胞之間形成的主要連接。TJ蛋白形成腸黏膜屏障，并決定腸壁的通透性[16]。閉鎖小帶1(ZO-1)、閉鎖蛋白和緊密連接蛋白-1是維持緊密連接的生理功能的3種關鍵蛋白，緊密連接被破壞會引起腸通透性的增加，使病原體和內毒素等有害物質轉移，從而導致組織損傷，ZO-1和閉鎖蛋白的增加會抑制這種情況[17]。少量的活性氧可促進有絲分裂，促進細胞增殖，而過量的活性氧會引發(fā)嚴重程度的氧化還原失衡，導致氧化應激，它可以通過DNA羥基化、蛋白質變性、脂質過氧化和膜破裂來破壞多種細胞成分，特別是活性氧的過量產生會導致線粒體損傷和氧化呼吸鏈中斷，最終導致細胞死亡。NF2L2-抗氧化反應(ARE)信號通路可以激活抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，從而增強小腸上皮細胞清除活性氧的能力，保護其免受氧化損傷[18]。

在研究藥物調控腸道修復因子的表達時，常關注以下4種因子：TGF-β1在細胞生長、分化、炎癥反應以及細胞凋亡等過程的調控中發(fā)揮極為重要的作用；EGFR在正常機體胃腸黏膜的上皮細胞分泌較少，損傷時可見其表達明顯增加；促細胞分裂因子EGF，能增強胃黏膜細胞抵抗胃酸的侵蝕能力，保護胃黏膜免受損傷因子破壞；IGF1參與糖、脂肪和蛋白質代謝，可刺激細胞代謝，刺激腸道細胞的增殖[19]。

2.2 腸上皮細胞體外模型用于中藥作用機制的研究

中藥種類繁多且大多數中藥的作用機理還未明確，對已明確的有效成分、有效部位采用動物腸上皮細胞體外模型進行作用機制的研究十分重要?，F就近年來有關中藥多酚類、多糖類、生物堿類、皂苷類及中藥方劑在動物腸上皮細胞中作用機制的研究進行分析。

2.2.1 天然多酚類 多酚類化合物是植物的重要次生代謝產物，主要包括酚酸、黃酮類、天然芪類、單寧和木脂素類，其中酚酸又包括羥基肉桂酸和羥基苯甲酸類，黃酮類又分為黃酮醇、黃酮、黃烷醇、黃烷酮、花青素和異黃酮類。天然來源的多酚成分具有多樣的生物學活性，如抗氧化、抗輻射、抗癌、降血壓等。但其相關的作用機制還未明確，因而研究其作用機制成為一項熱點。

杜仲黃酮(eucommia ulmoides flavones，EUF)是杜仲中分離的一類黃酮類化合物，具有清除自由基、提高免疫力、抗菌消炎、護肝、雌激素樣作用等。Tarique H等采用Western blot法測定了添加了EUF的LPS處理后的IPEC-J2細胞中的蛋白水平，發(fā)現EFU增加了磷酸化的Akt、IκBα和磷酸化的IKKα/β的基因表達，降低了Bax和caspase-3蛋白的基因表達，結果表明，EUF通過PI3K-NF-κB信號通路抑制LPS對IPEC-J2細胞的損傷[20]。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿中的一種黃酮類化合物，具有抗炎和抗氧化等作用，其磷酸化衍生物(pICA)也被證明具有有效的抗炎和抗氧化特性。Xiong W等發(fā)現ICA及pICA通過抑制IPEC-J2細胞的p38 MAPK基因和蛋白的表達來調節(jié)腸上皮細胞的炎癥反應和氧化應激，從而減輕產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)K88誘導的腸屏障功能和腸通透性的破壞。ICA和pICA處理后的細胞中活性氧、RNS、丙二醛和過氧化氫含量顯著降低，而超氧化物歧化酶、谷丙轉氨酶、過氧化氫酶和總抗氧化酶活性升高；ZO-1和閉鎖蛋白的基因和蛋白表達升高，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達降低[21]。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種非黃酮類多酚化合物，具有高效的抗氧化能力，許多研究表明，RES對氧化應激和細胞凋亡有保護作用。研究者通過測定細胞中Nrf2調節(jié)的抗氧化酶SOD1、GCLC和GCLM以及細胞核中的Nrf2的水平，發(fā)現RES顯著提高了SOD1、GCLC和GCLM的表達，并增加了Nrf2的核積累，說明白藜蘆醇通過Nrf2信號通路保護IPEC-J2細胞免受脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導損傷[22]。

姜黃素(Curcumin)是從姜科姜黃屬植物塊狀莖中提取分離出的一種天然疏水性多酚。姜黃素已被證明具有廣泛的有益生物特性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌和抗菌等。杜惜惜等發(fā)現姜黃素能有效抑制葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸上皮細胞NLRP3炎性小體活化，并減少促炎性細胞因子IL-1β分泌[23]。姜黃素可通過AMPK-TFEB信號通路改善氧化應激導致的腸屏障損傷和線粒體損傷。

2.2.2 多糖類 多糖是天然大分子，通過糖苷鍵連接。它們廣泛存在于植物、動物和微生物中，并參與體內多種細胞功能，如調節(jié)激素分泌、傳遞能量儲存。近年來，越來越多的植物多糖被分離和研究，發(fā)現多糖具有多種生物活性，如提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等。目前，國內外主要針對多糖類化合物的抗氧化作用機制進行研究。

Huang C等用離子交換層析和凝膠過濾對新疆枸杞多糖(XLBP)進行純化，得到了一種典型的果膠多糖XLBP-Ⅰ-Ⅰ。采用CCK-8測定法測定細胞毒性，XLBP-Ⅰ-Ⅰ對IPEC-J2細胞的毒性不超過50 μg/mL。XLBP-Ⅰ-Ⅰ可降低IPEC-J2細胞中GRP78的水平，使p-PERK、p-eIF2α、ATF-6和IRE-1的蛋白水平降低，說明XLBP-Ⅰ-Ⅰ減少了IPEC-J2細胞中的內質網應激[24]。

沙棘多糖具有抗炎和免疫調節(jié)作用，在預防和治療腸相關疾病中具有重要作用。有研究者發(fā)現沙棘多糖降低了LPS誘導的IPEC-J2細胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達，提高ZO-1、閉鎖蛋白和緊密連接蛋白-1的水平，降低TLR4和MyD88的水平，并抑制NF-κB的活化，說明沙棘多糖可以降低炎癥因子水平、細胞凋亡率，提高細胞免疫球蛋白、緊密連接蛋白水平并減輕細胞表面形態(tài)損傷，通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕由脂多糖誘導的IPEC-J2細胞損傷。

Qin T等使用鐮刀菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)感染IPEC-J2細胞，采用AO/EB染色比較猴頭菇多糖處理后細胞凋亡情況的變化，發(fā)現處理后的細胞凋亡數減少，且活性氧的產生減少，說明其可保護IPEC-J2細胞免受DON誘導的氧化應激[25]。靈芝多糖可以促進線粒體功能恢復，抑制細胞色素c、PARP、caspase-3 的激活，有效抑制由棕櫚酸引起的IPEC-J2細胞的細胞毒性和凋亡。黃芪多糖可以抑制LPS通過MAPK和NF-κB通路誘導的IPEC-J2細胞中炎癥因子和趨化因子的產生，并顯著減少壞死性凋亡[26]。巖藻糖膠能有效保護IPEC-1細胞免受H2O2誘導的氧化損傷。

2.2.3 生物堿類 生物堿類是主要來源于植物界的一類含氮有機化合物，多呈堿性，大多有較復雜的環(huán)狀結構，氮原子常結合在環(huán)內，有顯著的生物活性，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、解痙等。

鉤吻素子是鉤吻中含量最高的生物堿，已被證明可防止細胞受到過氧化氫誘導的氧化應激。鉤吻素子可以顯著激活 Ahr 受體，研究者們通過細菌侵染試驗發(fā)現鉤吻素子可以顯著減少沙門氏菌IPEC-J2 細胞的侵染，而 Ahr 受體抑制劑α-NF抑制這種效果，說明鉤吻素子通過激活Ahr受體減少了沙門氏菌對IPEC-J2細胞的侵染[27]。

還有研究者通過分析四甲基偶氮唑鹽和乳酸脫氫酶水平發(fā)現，鉤吻素子顯著降低脂多糖的細胞毒性。而通過分析TEER值證明鉤吻素子減緩了脂多糖誘導的腸屏障功能障礙。鉤吻素通過Nrf2 通路減少由LPS誘導產生的活性氧和丙二醛的量，還促進了超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的增加。結果顯示，鉤吻素子可有效抑制LPS通過Nrf2/NF-κB信號通路誘導的IPEC-J2細胞的損傷。

小檗堿又名黃連素，是從中藥黃連等植物中提取的異喹啉類生物堿，其硫酸鹽衍生物即硫酸小檗堿，在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床都具有確切的抗腹瀉功效，能明顯延長小腸傳遞時間，對治療消化道黏膜損傷和潰瘍效果較佳。徐懷葉等發(fā)現鹽酸小檗堿會促進豬輪狀病毒損傷的IPEC-J2細胞中TGF-β1和EGFR mRNA的表達，抑制EGF和IGF1mRNA表達，表明鹽酸小檗堿可通過調節(jié)損傷的腸黏膜上皮細胞修復因子的基因表達，對受損腸黏膜起到保護和修復作用[28]。

鹽酸小檗堿還可以抑制內質網應激caspase-12、caspase-3凋亡信號通路介導的小鼠腸上皮細胞凋亡。沈雁等采用CCK8法檢測發(fā)現鹽酸小檗堿使H2O2損傷的原代培養(yǎng)小鼠IEC細胞的存活率升高，凋亡率下降，同時，Western blot法檢測到細胞中GRP78、cleaved caspase-12和cleaved caspase-3的表達水平均明顯下降[29]。

2.2.4 皂苷類 皂苷具有抗腫瘤、降血糖、降膽固醇、保肝、免疫調節(jié)、抗炎、抗微生物等作用。近年來，皂苷的抗炎作用引起研究者的關注，動物腸上皮細胞也常用作研究皂苷類藥物抗炎作用的體外模型。黃芪甲苷(astragaloside IV，ASIV)是中藥黃芪的主要活性成分之一，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等作用。Wang Y F等[30]研究發(fā)現ASIV提高了牛小腸上皮細胞的過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的水平以及總抗氧化能力，抑制了活性氧的產生。通過Western blot法和熒光定量PCR檢測牛小腸上皮細胞中NF2L2-抗氧化反應中抗氧化酶血紅素氧合酶-1(HMOX1)和NQO1的表達，發(fā)現黃芪甲苷提高了NFE2L2、HMOX1和NQO1的蛋白水平，說明ASIV通過激活NF2L2-抗氧化反應信號通路保護牛小腸上皮細胞免受H2O2誘導的氧化損傷。

朱易平等[31]發(fā)現黃芪總皂苷可以促進大鼠小腸上皮細胞IEC-6細胞增殖，但對細胞遷移沒有影響。他們采用Western blot法檢測了多胺及其調控的細胞增殖相關蛋白的表達，發(fā)現黃芪總苷可以逆轉二氟甲基鳥氨酸導致的IEC-6增殖抑制，提高細胞中 c-Myc、RhoA 和 Cdk2 蛋白表達。

刺五加作為一種中草藥添加劑在動物生產中應用較為廣泛，具有抗炎、神經保護、免疫調節(jié)和血糖調節(jié)等作用。刺五加苷中主要的活性物質是刺五加苷 B 和刺五加苷 E。Che D等發(fā)現刺五加苷B降低了IPEC-J2細胞的細胞膜通透性，以及細胞中IL-6、IFN-γ、TNF-α等促炎細胞因子的基因表達。此外，刺五加苷B增加了腸緊密連接蛋白Claudin-3、Occludin、ZO-1和炎性細胞因子 IL-10、TGF-β的mRNA的表達[32]。有國內研究者發(fā)現刺五加苷E具有與刺五加苷B相同的作用，兩者均可通過改變細胞間緊密連接蛋白和細胞因子的表達促進腸道屏障的完整性。

2.2.5 中藥方劑 《傷寒論》所載葛根芩連湯，主要成分是葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿，可作為中獸藥理論用于治療斷奶后腹瀉。葛根素是從葛根中分離的一種異黃酮類衍生物，具有心臟保護、神經保護、抗氧化和抗炎癥活性以及減輕疼痛等作用。黃芩苷是從黃芩的根中提取的黃酮類化合物。鹽酸小檗堿是從黃連的根莖中分離得到的小檗堿的鹽酸鹽。黃連素長期用于治療胃腸道感染和腹瀉，并通過增強鈉離子和水的吸收部分發(fā)揮其止瀉作用[33]。

Liu X等[34]使用產腸毒素性大腸埃希氏菌(ETEC)感染IPEC-J2細胞，掃描電鏡觀察下細胞表面有大量ETEC細菌黏附，且細胞形態(tài)萎縮，感染3 h后，IPEC-J2細胞的凋亡率顯著增加，且IL-6 和CXCL-2 mRNA表達增加，而葛根素、黃芩苷和小檗堿治療的細胞保持了正常的結構和形態(tài)，凋亡率沒有顯著變化，且IL-1、IL-6、CXCL-2和PLAU的表達降低。研究證明了葛根素、黃芩苷和鹽酸小檗堿可以減少IPEC-J2細胞中ETEC通過NF-κB信號通路誘導的炎性反應。

復方參術湯可以抑制引起細胞凋亡的線粒體通路，從而預防豬傳染性胃腸炎病毒引起的豬小腸黏膜上皮細胞凋亡。王飛雪等[35]采用熒光定量PCR和Western blot法檢測發(fā)現，復方參術湯降低了豬傳染性胃腸炎病毒感染的豬小腸黏膜上皮細胞Bax、caspase-9、caspase-3、Cytc及Bid的蛋白表達，增加了細胞中Bcl-2基因與蛋白的表達量[35]。

3 小結

根據上述內容可總結出，中藥的天然多酚類、多糖類、皂苷類及中藥方劑通過各種機制，顯著維持動物腸上皮細胞的完整性及功能，包括抑制TJ蛋白表達損傷、抑制促炎性因子表達以及增加抗炎性因子的表達、激活超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的作用等。在動物腸上皮體外模型應用于中藥作用機制的研究中發(fā)現，中藥中杜仲黃酮和淫羊藿苷等黃酮類物質具有良好的抗炎、抗氧化作用，黃芪多糖、猴頭菇多糖等多糖類物質以及姜黃素、鉤吻素子、黃芪甲苷等在抑制真菌毒素等誘導的氧化應激方面具有顯著作用，葛根芩連湯、復方參術湯分別抑制大腸桿菌、豬傳染性胃腸炎病毒導致的腸道損傷。

腸上皮細胞的體外模型目前大多來自人、豬和鼠，且已有穩(wěn)定的細胞系被建立并運用于各項研究。但有關其他物種的腸上皮細胞的建立仍在持續(xù)研究中。建立穩(wěn)定且特異性的動物腸上皮細胞體外模型對于研究腸道致病菌、食品、藥品等具有重要意義。細胞培養(yǎng)方法簡單、生命力強，細胞體外模型相比動物實驗具有省時、經濟的優(yōu)點，且細胞模型可同時、大批量對藥物進行篩選，所需藥物量少、節(jié)約資源，體外細胞模型還可有效減少實驗動物的使用。在動物腸上皮細胞體外模型中，常采用TEER和示蹤劑通量評價腸上皮完整性和通透性，一般采用熒光定量PCR和Western blot法測量緊密連接蛋白基因的轉錄水平和蛋白質表達水平，評價腸屏障損傷。在體外實驗中，將藥物與細胞共同孵育一段時間后，測定能夠反應細胞活性的酶量、TEER值等，評價其對細胞活性的影響以及觀察細胞吸收藥物的機制；或將藥物與有害物質預處理后的細胞共同培養(yǎng)，通過觀察細胞的形態(tài)、炎性因子或蛋白表達的變化等，了解藥物的作用機制。

中藥在動物疾病治療中應用中越來越廣泛，受到了人們的關注。目前，有許多中藥在動物細胞上的作用機制還不明確，相信動物腸上皮細胞模型會越來越多的應用于藥物研究領域，明確藥物作用機制，為已有獸藥的改良和新獸藥的研發(fā)提供理論支持。