任晨洋，馬巍威，張 瑩

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院/東北畜禽疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110161)

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，為8節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，是人類呼吸道感染的主要病因之一，可以導(dǎo)致每年的季節(jié)性流感和偶爾的流感大流行。IAV基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白1(non-structural protein 1,NS1)是影響病毒致病性的關(guān)鍵毒力因子，為宿主免疫反應(yīng)的強(qiáng)效拮抗劑，在IAV感染過程中發(fā)揮重要的作用。

NS1是由IAV第8個(gè)RNA節(jié)段編碼的高度保守的多功能蛋白，分子質(zhì)量約為26 ku，含有215～237個(gè)氨基酸。其分為4個(gè)不同的區(qū)域：位于N端的RNA結(jié)合區(qū)(RNA-binding domain,RBD)、連接區(qū)以及位于C端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(effector domain,ED)和C端尾巴。RBD和ED兩個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域通過與大量宿主蛋白相互作用來促進(jìn)NS1的免疫抑制作用。NS1主要以開放構(gòu)象存在于溶液中，表現(xiàn)出不依賴于毒株的結(jié)構(gòu)可塑性，使其能夠在病毒感染期間與多種細(xì)胞因子配體相互作用[1]，在拮抗宿主干擾素(interferon,IFN)、抑制細(xì)胞凋亡、抑制宿主mRNA的加工和核輸出、促進(jìn)病毒mRNA的翻譯等方面發(fā)揮作用。本文將對(duì)IAV NS1蛋白的功能作系統(tǒng)介紹。

1 NS1促進(jìn)IAV復(fù)制

IAV M基因轉(zhuǎn)錄后的M1 mRNA經(jīng)選擇性剪接后可以編碼多種蛋白，而NS1可以調(diào)控M1 mRNA的剪接，這一活性依賴于NS1的RNA結(jié)合能力，NS1還能通過與細(xì)胞NS1結(jié)合蛋白相互作用，使M1 mRNA向核散斑(nuclear speckles)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)M1 mRNA剪接[2]。根據(jù)IAV基因組編碼蛋白的表達(dá)動(dòng)力學(xué)，其基因可以分為早期與晚期兩類。由于RNA聚合酶Ⅱ抑制劑的存在，病毒晚期基因的mRNA核輸出依賴于宿主細(xì)胞內(nèi)的NXF1/TAP途徑，NS1通過充當(dāng)病毒mRNAs和NXF1之間的適配分子來促進(jìn)病毒晚期基因mRNAs的核輸出，這依賴于NS1的RBD結(jié)構(gòu)域[3]。

NS1可以與病毒5’UTR、宿主的核多聚腺苷酸結(jié)合蛋白1(nuclear poly(A)binding protein,PABP1)和真核翻譯起始因子4G(eukaryotic initiation factor 4G,eIF4G)結(jié)合，從而特異性地增強(qiáng)病毒mRNAs的翻譯。NS1雖然可以直接與mRNA結(jié)合，但這與其刺激翻譯的能力并不相關(guān)。增強(qiáng)病毒mRNA的翻譯依賴于NS1與核糖體結(jié)合并招募它們靶向mRNA的特性，其中RBD中的R38和K41是關(guān)鍵氨基酸殘基[4]。有研究表明當(dāng)NS1與病毒dsRNA結(jié)合后，競爭性的抑制NS1與PABP1的結(jié)合，這表明dsRNA對(duì)NS1和PABP1相互作用的調(diào)節(jié)在病毒周期中可能是重要的[5]。

2 IAV NS1的免疫逃逸機(jī)制

2.1 NS1抑制IFN相關(guān)轉(zhuǎn)錄活化因子的產(chǎn)生

IAV侵入宿主呼吸道上皮細(xì)胞后，存在于感染細(xì)胞胞漿內(nèi)的維甲酸誘導(dǎo)基因I(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)識(shí)別IAV的RNA，發(fā)生構(gòu)象變化，其caspase 募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)被釋放出來，招募三重基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)等E3泛素連接酶，催化RIG-I發(fā)生K63泛素化修飾進(jìn)而激活下游的線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)，傳遞抗病毒信號(hào)，激活核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors,IRF)等轉(zhuǎn)錄活化因子并向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，使I型IFNs大量表達(dá)[6]。

Rashmi等在RIG-I的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/Enhancer Binding Protein β,C/EBPβ)的結(jié)合位點(diǎn)，并表明NS1促進(jìn)C/EBPβ磷酸化，并以C/EBPβ/NS1復(fù)合物的形式募集RIG-I啟動(dòng)子，從而抑制RIG-I的轉(zhuǎn)錄[7]。NS1 RBD與轉(zhuǎn)錄后的RIG-I pre-mRNA內(nèi)含子序列相結(jié)合，改變pre-mRNA的加工過程，以抑制RIG-I的表達(dá)[8]。去泛素化酶OTUB1 水解K48多泛素鏈和與重組人泛素偶聯(lián)酶UBCH5c形成E2抑制復(fù)合物是RIG-I發(fā)生K63泛素化的前提條件。NS1 ED可以引起OTUB1蛋白酶降解[9]，RBD則直接與RIG-I的CARD2和TRIM25的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域相互作用，阻遏RIG-I的泛素化。有研究表明，NS1 R21殘基在與CARD2的結(jié)合中發(fā)揮了重要作用，R21Q突變抑制了兩者的結(jié)合能力，但不會(huì)影響NS1與TRIM25的結(jié)合[10]。NS1還能通過S42殘基阻斷IRF3的激活，以及誘導(dǎo)負(fù)調(diào)控IRF3的泛素編輯蛋白A20(也稱TNFAIP3)大量表達(dá)來抑制Ⅰ型IFNs的產(chǎn)生。

2.2 NS1抑制宿主蛋白pre-mRNA的加工成熟

剪切和多聚腺苷酸化特異性因子4(cleavage and polyadenylation specific factor 4,CPSF4)是pre-mRNA加工成熟的必需蛋白酶，它在細(xì)胞核內(nèi)裂解pre-mRNA并將Poly(A)尾巴添加到pre-mRNA的3’末端，增加mRNA的穩(wěn)定性，使mRNA能進(jìn)行核輸出并翻譯。NS1的F103和M106殘基與CPSF4鋅指結(jié)構(gòu)域F2F3中的L72、Y88和P111等殘基相互作用，使NS1與CPSF4結(jié)合，阻止pre-mRNA的加工成熟及核輸出，使宿主蛋白的pre-mRNA在細(xì)胞核中大量堆積，抑制包括IFN在內(nèi)的多種具有抗病毒作用的宿主蛋白表達(dá)。F103和M106還有助于轉(zhuǎn)錄后抑制抗病毒干擾素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。Li等通過分析三株H5N1毒株發(fā)現(xiàn)NS1第55、66、133位殘基影響其與CPSF4的結(jié)合。NS1/CPSF4復(fù)合體會(huì)調(diào)節(jié)宿主基因的選擇性剪接，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53。NS1/CPSF4調(diào)節(jié)TP53轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接，表達(dá)p53異構(gòu)體，以此來拮抗p53介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)[11]。RNA解旋酶UAP56在真核細(xì)胞中參與pre-mRNA的剪接和核輸出。NS1 RBD 殘基R38和K41可以與UAP56相結(jié)合，但不影響NS1介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制，其確切作用有待確認(rèn)[12]。

2.3 NS1抑制細(xì)胞凋亡

PI3K是由調(diào)節(jié)性p85β亞基和催化性p110亞基組成的異源二聚體酶。PI3K的激活可以抑制凋亡蛋白caspase-9與調(diào)控細(xì)胞代謝的糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的活化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。NS1 ED通過與p85β亞基的iSH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活p110亞基，延緩細(xì)胞凋亡或改變PI3K的細(xì)胞分布為IAV復(fù)制帶來有利條件[13]。1918年大流感的流感病毒NS1還劫持了另一種宿主蛋白CT10激酶調(diào)節(jié)因子(CT-10 regulator of kinase,CRK)，并通過ED的構(gòu)象變化與P85β結(jié)合，形成三元復(fù)合物，導(dǎo)致PI3K的過度激活[14]。細(xì)胞壞死性凋亡是細(xì)胞凋亡受到抑制時(shí)出現(xiàn)的一種細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制，IAV的NS1與磷酸化混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域2相互作用，增加了MLKL的寡聚和膜轉(zhuǎn)位，破壞質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。同時(shí)，MLKL和NS1相互作用增強(qiáng)MLKL介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)分泌增加[15]。有關(guān)NS1引起細(xì)胞壞死性凋亡的具體機(jī)制目前尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

2.4 NS1其他免疫逃逸機(jī)制

鋅指抗病毒蛋白(Zinc finger antiviral protein,ZAP)是一種具有抗病毒活性的宿主細(xì)胞限制因子，介導(dǎo)病毒mRNA的降解，NS1通過抑制ZAP與靶mRNA的結(jié)合拮抗其抗病毒活性[16,17]。RNA解旋酶MOV10通過與IAV NP相互作用，將病毒RNP隔離在細(xì)胞質(zhì)中，NS1通過溶酶體途徑降解MOV10[18]。NS1抑制c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)和自噬小體對(duì)vRNP的隔離[19]。蛋白激酶R(protein kinase RNA activated,PKR)是一種可以抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的蛋白激酶，在病毒感染細(xì)胞時(shí)激活。NS1的123-127位氨基酸和 N端高度保守的R35和R46可以結(jié)合并阻斷PKR的激活[20]，保證病毒復(fù)制。

NS1能通過靶向NF-κB下調(diào)NLRP3炎性小體的激活，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子水平的降低。Hong-Su等發(fā)現(xiàn)2009年大流行的H1N1亞型流感病毒 NS1的C末端可以抑制ASC泛素化進(jìn)而下調(diào)NLRP3介導(dǎo)的IL-1β的產(chǎn)生[21]。

RNA干擾是否構(gòu)成哺乳動(dòng)物體細(xì)胞抗病毒先天免疫反應(yīng)的一部分仍然存在爭議，NS1缺陷的IAV比野生型IAV在人類體細(xì)胞中產(chǎn)生了更高水平的siRNAs，但這些siRNAs實(shí)際上并不顯著抑制IAV基因的表達(dá)。要證實(shí)NS1的RNA沉默抑制活性，還需要對(duì)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)行更多的研究。

除了多種細(xì)胞內(nèi)功能外，NS1還可以通過直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子Ci/Gli的比活性來改變Hedgehog(HH)靶基因的表達(dá)，改變細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響IAV的復(fù)制[22]。

3 NS1與IAV進(jìn)化

Chauché等通過鑒定馬IAV的NS1，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化上不同的NS1通過不同的機(jī)制來抑制IFN反應(yīng)，早期馬IAV NS1通過與CPSF結(jié)合來阻止一般基因的表達(dá)，而較晚的NS1通過干擾JAK/STAT途徑特異性地阻止IFN的產(chǎn)生，這與進(jìn)化過程中先后出現(xiàn)的2個(gè)突變有關(guān)。說明病毒進(jìn)化和免疫逃逸之間的相互作用在IAV哺乳動(dòng)物適應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[23]。蝙蝠IAV NS1在拮抗IFN應(yīng)答方面不如傳統(tǒng)的IAV NS1有效，但這種不足通過PB2的特異性突變進(jìn)行了彌補(bǔ)[24]。Antonio等通過結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的丙氨酸掃描了NS1 p85β結(jié)合域，研究不同IAV的結(jié)合譜，揭示了在人類中傳播進(jìn)化的IAV NS1功能的動(dòng)態(tài)演變[25]。

阻斷宿主基因表達(dá)的能力不是流感病毒在哺乳動(dòng)物中復(fù)制所必需的，但在禽流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的長期適應(yīng)中可能是重要的，犬流感H3N8 NS1能夠有效地抑制IFN的反應(yīng)，但不能阻止一般基因的表達(dá)，這可以通過將H3N8 NS1中的K186替換為H3N2 NS1中的E186來恢復(fù)，在犬H3N8和H3N2之間觀察到的186位氨基酸多態(tài)性可能是禽源性IAV在哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得適應(yīng)性變化的結(jié)果[26]。2009年大流行的H1N1亞型流感病毒不能抑制一般宿主基因的表達(dá)，但目前流行的H1N1亞型流感病毒的NS1與原始蛋白相比發(fā)生了6個(gè)氨基酸變化，通過恢復(fù)與CPSF的結(jié)合的能力恢復(fù)了pH1N1 NS1抑制宿主基因表達(dá)的能力，這可能代表了H1N1亞型流感病毒對(duì)人類的適應(yīng)[27]。

4 以NS1為靶點(diǎn)的IAV預(yù)防措施

NS1蛋白由于其結(jié)構(gòu)、多重相互作用和在IAV復(fù)制和發(fā)病機(jī)制中的功能，是最有前途的新型抗流感藥物靶點(diǎn)之一。Hiba等通過對(duì)NS1的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在RBD上存在一個(gè)能夠滿足可制藥性標(biāo)準(zhǔn)的潛在結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)[28]。Alex等通過對(duì)A9(JJ3297)、A22進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，確定它們與NS1 ED 上的CPSF結(jié)合區(qū)域相互作用，這為兩種針對(duì)NS1的抗流感化合物的作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[29]。

在流感病毒進(jìn)化過程中NS1 C端有時(shí)會(huì)自然發(fā)生截短突變，削弱抑制干擾素的作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減弱病毒的復(fù)制和致病性[30]。Aitor等基于NS1的截短或完全缺失表現(xiàn)出減毒作用，并保持免疫原性的特點(diǎn)，制備了重組H3N8 犬流感疫苗[31]。Christina等評(píng)估了基于NS1基因缺失的H5N1減毒活疫苗在人類中的安全性和免疫原性，證明免疫后能誘導(dǎo)出顯著水平的疫苗特異性抗體[32]。Aitor等驗(yàn)證了表達(dá)異型流感(B型、C型、D型)病毒NS1的重組IAV毒力減弱，支持了其用于開發(fā)安全有效的減毒活疫苗的可行性[33]。

Laura等發(fā)現(xiàn)人miRNA hsa-miR1307-3p是一種能有效抑制H1N1 IAV NS1表達(dá)和病毒復(fù)制的基因，有望用于抗病毒新療法的開發(fā)[34]。

5 展望

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全世界每年約有10%的人口感染流感病毒，29萬至65萬人因此而死亡[1]。而IAV屬于RNA病毒，變異速度快，使其預(yù)防成為難題。NS1作為流感病毒的主要毒力因子之一，參與了病毒侵襲宿主細(xì)胞的各個(gè)階段，其通過與多種宿主因子和RNA相互作用，在拮抗抗病毒反應(yīng)，促進(jìn)病毒復(fù)制、傳播、適應(yīng)性進(jìn)化等方面的發(fā)揮重要作用，因此深入研究NS1對(duì)于預(yù)防IAV具有重大意義。不同物種、不同毒株間的NS1存在功能性差異，這是流感病毒多樣性特征的關(guān)鍵因素之一，有助于我們深入研究流感病毒的感染機(jī)制。例如傳統(tǒng)的IAV NS1 p85β結(jié)合域在蝙蝠的IAV NS1中不能與PI3K的p85β亞基結(jié)合，無法有效激活PI3K通路，這說明在NS1上可能還存在一個(gè)未發(fā)現(xiàn)的負(fù)責(zé)PI3K激活的區(qū)域[35]。

IAV NS1上存在許多功能化位點(diǎn)，如乙酰化修飾位點(diǎn)K108、2個(gè)磷酸化位點(diǎn)Y73和S83、H5N1中保守的Y84殘基，2009年H1N1亞型IAV中的Y171[8]等，這些氨基酸位點(diǎn)可以作為抗病毒藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。目前已獲得了針對(duì)NS1的先導(dǎo)化合物，這是研究NS1導(dǎo)向的新型抗病毒藥物的基礎(chǔ)，而NS1截短型和缺失型重組病毒的毒力顯著減弱也表現(xiàn)出NS1在流感疫苗研發(fā)上具有不俗的潛力。未來NS1抑制劑與NS1缺陷疫苗將會(huì)成為預(yù)防和控制流感病毒流行的有力武器。