周淑棉，劉夢倩,樊丹陽，胡庭俊

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西大學(xué)圖書館，廣西南寧 530004)

炎癥是免疫系統(tǒng)對(duì)感染、損傷或刺激的第一反應(yīng)，在進(jìn)行疾病診斷過程中，紅、腫、熱、疼是炎癥反應(yīng)的基本臨床表現(xiàn)[1]。有證據(jù)表明抗炎作用是通過調(diào)節(jié)各種炎性細(xì)胞因子水平來實(shí)現(xiàn)的，如干擾素、白介素類，腫瘤壞死因子和一氧化氮等[2]。類固醇和非類固醇類抗炎藥作為炎癥的常規(guī)療法，顯示出多種不足和副作用[3]。有鑒于此，天然的抗炎活性藥物可作為一個(gè)替代選擇。傳統(tǒng)中藥以其毒性小、不易形成耐藥性和安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[4-5]。近年來，有關(guān)中藥聯(lián)合使用在抗炎作用中的良好效果有較多報(bào)道。熊穎[6]綜合60例臨床病例分析得出，柴胡桂枝干姜湯在臨床上可用于治療慢性淺表性胃炎。張輝果等[7]研究發(fā)現(xiàn)，小兒柴桂退熱顆?？梢酝ㄟ^降低患兒體內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平，輔助治療患兒急性上呼吸道感染并改善其臨床癥狀。柴桂口服液是一種復(fù)方中藥制劑，方源自張仲景的《傷寒論》中的柴胡桂枝干姜湯，具有小柴胡湯與理中湯合方之義，由小柴胡湯減去半夏、人參、大棗、生姜，加上干姜、桂枝、牡蠣和天花粉而成[8]。有研究表明[9]，柴桂制劑在抗炎、抗病毒及增強(qiáng)機(jī)體免疫方面作用顯著，目前未見有柴桂制劑在動(dòng)物炎癥性疾病防治方面的研究。因此，本研究旨在明確柴桂口服液的體外抗炎特性，為研發(fā)具有抗炎功效的柴桂制劑提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和細(xì)胞 柴桂口服液，河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司研制，規(guī)格為1.44 g/mL(即每1 mL柴桂口服液相當(dāng)于原生藥1.44 g)，100 mL/瓶，批號(hào)20190901；小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞研究所。

1.1.2 主要試劑 CCK-8試劑盒(批號(hào)A311-02-AA)，南京諾維贊生物科技有限公司產(chǎn)品；脂多糖(LPS)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；小鼠TNF-α測試盒(批號(hào)M190919-102a)、IL-6測試盒(批號(hào)M190919-004a)、IL-1β測試盒(批號(hào)M190930-001b)和IL-8 測試盒(批號(hào)M190930-104b)，均為深圳欣博盛生物科技有限公司產(chǎn)品；一氧化氮測試盒(批號(hào)20191007)，南京建成生物研究所產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能微孔板檢測儀(INFINITE M200 PRO)，瑞士TECAN公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡(TS100-F)，Nikon公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱(C150)，德國BINDER公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)定量PCR儀(CFX 96)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCITENTZ)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法測定柴桂口服液對(duì)RAW264.7安全濃度試驗(yàn) 設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和不同濃度藥物組(800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL和12.5 μg/mL)，每組8個(gè)重復(fù)。將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞消化后輕輕吹打至單個(gè)細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度至4×105個(gè)/mL，每孔100 μL加至96孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。第2 d棄上清，PBS洗2次，藥物組每孔加入100 μL上述稀釋好的藥物，細(xì)胞對(duì)照組加入100 μL細(xì)胞維持液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出96孔培養(yǎng)板吸棄培養(yǎng)液，PBS洗3次后，每孔加入100 μL含100 g/L的CCK-8的DMEM高糖完全培養(yǎng)液，避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀測OD 450 nm值。

1.2.2 柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、LPS對(duì)照組(1 μg/mL)及3個(gè)不同濃度的柴桂口服液藥物組(100 μg/mL、50 μg/mL及25 μg/mL)。每組3個(gè)重復(fù)。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞調(diào)整濃度為5×106cells/mL，按2 mL/孔接種于12孔培養(yǎng)板中。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過夜使細(xì)胞貼壁。第2 d吸棄上清，藥物組加入稀釋好的各濃度柴桂口服液2 mL，孵育1 h后，除空白對(duì)照組外，其他各組加入LPS(終濃度1 μg/mL)處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h時(shí)收集細(xì)胞及上清液，樣品(含細(xì)胞及上清液)經(jīng)超聲破碎處理后，嚴(yán)格按照ELISA檢測試劑盒的程序操作進(jìn)行測定IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及NO的水平。

1.2.3 RT-PCR測定柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平 試驗(yàn)分組及處理同1.2.2。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)處理培養(yǎng)24 h，PBS洗3次，每孔加入0.5 mL TRlzol裂解液，傳統(tǒng)法提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序參考ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書操作。引物序列見表1。

表1 檢測RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子的Real-time PCR引物

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 柴桂口服液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

通過CCK-8法測定了柴桂口服液對(duì)RAW 264.7細(xì)胞24 h細(xì)胞活性的影響。由表2可見，LPS刺激細(xì)胞24 h，柴桂口服液在200 μg/mL～800 μg/mL顯著降低細(xì)胞的存活率(P<0.05)。12.5 μg/mL～100 μg/mL的柴桂口服液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率無顯著影響，與細(xì)胞對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。因此，篩選藥物濃度為100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL進(jìn)行下一步的抗炎試驗(yàn)。

表2 柴桂口服液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(Mean±SD,n=8)

2.2 柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

LPS處理細(xì)胞24 h，LPS模型組RAW264.7細(xì)胞分泌炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及NO的水平極顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.01)，而經(jīng)過不同濃度的柴桂口服液處理后，能有效減少上述細(xì)胞因子的分泌量。

與細(xì)胞對(duì)照組比較，LPS刺激細(xì)胞后IL-6的水平極顯著上調(diào)(P<0.01)；與LPS模型比較，25 μg/mL～100 μg/mL的柴桂口服液均極顯著降低細(xì)胞分泌IL-6的水平(P<0.01)；柴桂口服液100 μg/mL組細(xì)胞IL-6水平極顯著低于25 μg/mL和50 μg/mL組(P<0.01)。呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

LPS刺激后細(xì)胞分泌IL-8水平升高，LPS模型組細(xì)胞IL-8的水平極顯著升高(P<0.01)；與LPS模型組相比，25 μg/mL～100 μg/mL的柴桂口服液均能極顯著降低IL-8的水平(P<0.01)。柴桂口服液100 μg/mL和50 μg/mL組的IL-8水平均極顯著低于25 μg/mL組，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

LPS刺激后細(xì)胞分泌IL-1β的水平升高，與細(xì)胞對(duì)照組比較，LPS刺激細(xì)胞后IL-1β的水平極顯著升高(P<0.01)；與LPS模型相比，25 μg/mL～100 μg/mL的柴桂口服液均極顯著降低細(xì)胞分泌IL-1β水平(P<0.01)。柴桂口服液100 μg/mL組的IL-1β水平極顯著低于25 μg/mL和50 μg/mL組(P<0.01)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

與細(xì)胞對(duì)照組比較，LPS刺激細(xì)胞后TNF-α的水平極顯著上調(diào)(P<0.01)；與LPS模型相比，25 μg/mL～100 μg/mL的柴桂口服液均極顯著降低細(xì)胞分泌TNF-α的水平(P<0.01)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

與細(xì)胞對(duì)照組比較，LPS刺激細(xì)胞后NO的水平極顯著升高(P<0.01)；與LPS模型相比，25 μg/mL～100 μg/mL的柴桂口服液均極顯著降低細(xì)胞分泌NO的水平(P<0.01)。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，LPS刺激細(xì)胞后，顯著促進(jìn)了炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及NO的分泌，而用柴桂口服液處理后，明顯降低了上述因子的水平，表明柴桂口服液能降低由LPS引起的細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及NO的分泌水平，從而產(chǎn)生良好的抗炎效果。

表3 柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎性因子的調(diào)節(jié)作用(Mean±SD,n=3)

2.3 柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎性細(xì)胞因子mRNA水平調(diào)節(jié)作用

結(jié)果如表4，LPS刺激細(xì)胞后，RAW264.7細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α及iNOS的mRNA表達(dá)水平極顯著升高，與細(xì)胞對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，柴桂口服液能有效拮抗上述炎癥因子mRNA的過度表達(dá)。與LPS模型組比較，藥物組細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA的表達(dá)水平均被極顯著抑制(P<0.01)，并且藥物濃度越高，抑制效果越明顯。

表4 柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)作用(Mean±SD,n=3)

3 討論

炎癥是動(dòng)物體對(duì)各種致炎因素及其所引起的損傷產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，可以定義為促炎因子的順序釋放。細(xì)胞因子在炎癥過程中通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織內(nèi)細(xì)胞因子的平衡，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等可促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集、活化和炎癥介質(zhì)釋放，影響著炎癥的發(fā)生發(fā)展[10-12]。有研究報(bào)道證實(shí)[13]，中藥可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化、凋亡以及免疫活性，抑制炎癥相關(guān)因子的過度釋放，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)及控制炎癥進(jìn)展。

M.DNA Marker 2 000；1～5.CELL組、LPS組、25 μg/mL組、50 μg/mL組及100 μg/mL組

抑制炎癥因子的分泌是中藥發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要方式之一，近年來有關(guān)中藥復(fù)方制劑抗炎效果的報(bào)道被證實(shí)。張麗娜等[14]發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方能有效抑制小鼠鏈球菌性肺炎p38MAPK信號(hào)通路的活化，控制炎癥進(jìn)程。三黃方通過抑制細(xì)胞因子NO、IL-1β、PGE-2和TNF-α釋放，發(fā)揮抗炎效果，且其在治療炎癥性疾病時(shí)毒性較低[15]。黎濤等研究發(fā)現(xiàn)，柴桂退熱顆粒聯(lián)合炎琥寧能夠通過抑制炎癥因子hs-CRP、TNF-1α、IL-4的產(chǎn)生來緩解炎癥的臨床癥狀[16]。多種中藥及復(fù)方均可通過下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)IKKβ、JNK、NF-κB和MAPK的磷酸化水平，抑制NF-κB、JNK和MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而減少促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β等的合成[17]。研究表明，中藥還可通過抑制巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活性來下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而減少IL-12、TNF-α和NO等促炎因子的合成與釋放[18]。劉俊等[19]發(fā)現(xiàn)野黃芩苷可降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)JNK和p38的磷酸化水平，抑制MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而降低TNF-α的表達(dá)，并上調(diào)TGF-β與IL-10的表達(dá)水平。丹參寧膠囊是臨床用于治療非酒精性脂肪性肝炎的有效藥物，研究證實(shí)其可通過上調(diào)巨噬細(xì)胞中microRNA-152的表達(dá)來降低TNF-α和IL-6 的mRNA的表達(dá)水平，從而抑制TNF-α和IL-6的分泌，減輕炎癥反應(yīng)[20]。黃芩素能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞COX-2的活性，阻止轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與DNA結(jié)合，從而抑制花生四烯酸的代謝而產(chǎn)生抗炎作用；柴胡皂苷a與柴胡皂苷d通過抑制LPS的活性，以減少細(xì)胞中COX-2和iNOS的表達(dá)；桂枝揮發(fā)油具有良好的抗炎、免疫及促軟骨細(xì)胞增殖等藥理活性[21-23]。

抑制炎癥因子抑制炎性介質(zhì)特別是炎性細(xì)胞因子，如白介素IL-1β、IL-6和TNF-α的過度產(chǎn)生可能預(yù)防或抑制多種炎性疾病[24]。本試驗(yàn)通過LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，觀察柴桂口服液對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞中IL-6、IL-8、IL-1β、NO及TNF-α的水平極顯著升高，不同濃度藥物處理后，極顯著降低了上述炎癥因子的分泌及相關(guān)炎癥基因的mRNA表達(dá)。提示柴桂口服液能抑制因LPS導(dǎo)致的炎癥因子的過度分泌，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的平衡，從而減緩炎癥造成的損傷。