隋國(guó)燕，李世宏，秦 哲，陳長(zhǎng)青，崔小七，周 衡，張財(cái)?shù)?，朱新榮，李劍勇*，唐 峰*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州，121001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；3.鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南鄭州 730050；4.甘肅荷斯坦奶牛繁育示范中心，甘肅蘭州 730050)

奶牛乳房炎(bovine mastitis，BM)是由化學(xué)、物理因素等刺激或多種病原微生物侵入乳房組織所引起的炎癥反應(yīng)，是世界奶牛養(yǎng)殖中的常見(jiàn)疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，該病普遍存在于世界各地，在美國(guó)、挪威、芬蘭和瑞典因BM引起的奶牛淘汰率為26.5%、19.0%、35.0%和22.0%。我國(guó)奶牛乳房炎的發(fā)病率高于世界平均水平，因此病導(dǎo)致的淘汰率約為35%[2]。乳房炎可導(dǎo)致乳汁產(chǎn)生物理、化學(xué)和微生物學(xué)變化及乳腺組織的病變，并影響奶牛繁殖力、產(chǎn)奶量和乳制品品質(zhì)，不僅增加獸醫(yī)治療和管理費(fèi)用，而且威脅人類的健康[3]。奶牛乳房炎的臨床癥狀可分為臨床型和隱性型，據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床型乳房炎(Clinical mastitis，CM)占總發(fā)病率的21%～30%。CM臨床癥狀明顯，可出現(xiàn)乳區(qū)化膿、壞疽、萎縮等癥狀，也可導(dǎo)致永久性失去泌乳能力，其淘汰奶牛占總淘汰率相對(duì)較高[4-5]。細(xì)菌性乳房炎是BM最常見(jiàn)的病因，主要病原菌為葡萄球菌和鏈球菌，其次是大腸桿菌和酵母樣菌等?？股啬壳叭允侵委熂?xì)菌性乳房炎的首選方案。在多種劑型中抗生素乳房注入劑是最快捷和最有效的劑型[6]。阿莫西林具有廣譜、殺菌作用強(qiáng)的特點(diǎn)，但在某些地區(qū)存在一定的耐藥率[7]。臨床上解決耐藥性的問(wèn)題可采用聯(lián)合用藥的方式，復(fù)方阿莫西林是將阿莫西林、舒巴坦鈉及潑尼松龍聯(lián)合制備，其能夠有效提高藥物的抗菌活性，拓寬抗菌譜，增強(qiáng)敏感度，能夠有效抑制引起B(yǎng)M的常見(jiàn)病原菌，并且具有消炎作用，從而緩解乳腺組織紅腫、脹痛等臨床癥狀，對(duì)治療BM效果良好。為滿足奶牛養(yǎng)殖業(yè)對(duì)復(fù)方阿莫西林的市場(chǎng)需求，本研究對(duì)鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)的復(fù)方阿莫西林乳房注入劑進(jìn)行臨床療效評(píng)價(jià)，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 70頭泌乳期患有CM的荷斯坦奶牛選自甘肅某兩個(gè)奶牛場(chǎng)。所有試驗(yàn)?zāi)膛６荚跇?biāo)準(zhǔn)化牛棚隔離飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①患病乳區(qū)出現(xiàn)紅腫、熱感、疼痛等癥狀，且無(wú)其他疾病的泌乳期奶牛；或乳汁中出現(xiàn)膠凍狀凝塊、絮狀物以及顏色發(fā)生改變等癥狀。②當(dāng)前泌乳期沒(méi)有臨床乳房炎(單個(gè)乳區(qū))治療史。③只有單個(gè)乳區(qū)發(fā)生臨床型乳房炎。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有異常乳區(qū)/乳房構(gòu)造的奶牛(如缺少乳區(qū)、不產(chǎn)奶乳區(qū)、乳頭受損及下垂的乳房)。②桀驁不馴，試驗(yàn)難以駕馭的奶牛。③奶牛發(fā)生影響試驗(yàn)結(jié)果的全身或并發(fā)疾病的臨床癥狀。④納入前28 d內(nèi)用過(guò)抗生素(全身或乳房?jī)?nèi))治療的試驗(yàn)?zāi)膛！＂菁{入前3 d內(nèi)用過(guò)非甾體抗炎藥(NSAIDs)。⑥兩個(gè)或兩個(gè)以上乳區(qū)發(fā)生臨床型乳房炎的試驗(yàn)?zāi)膛！?/p>

剔除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)生伴發(fā)疾病的奶牛，如全身性疾病或其它需要抗生素或/和抗炎藥物治療的病癥。②不允許偏離研究結(jié)果的配合治療(抗生素或非甾體抗炎藥)。③其他嚴(yán)重偏離試驗(yàn)方案者。

1.1.2 試驗(yàn)用藥品 試驗(yàn)用藥：復(fù)方阿莫西林乳房注入劑(批號(hào)為20190702)，由鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)，規(guī)格為3 g；阿莫西林三水物 0.2 g(以阿莫西林計(jì))+舒巴坦鈉 0.05 g(以舒巴坦計(jì))+潑尼松龍 0.01 g。對(duì)照用藥：復(fù)方阿莫西林乳房注入劑(批號(hào)為1808005)，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為12 g；阿莫西林三水物 0.8 g(以阿莫西林計(jì))+舒巴坦鈉 0.2 g(以舒巴坦計(jì))+潑尼松龍0.04 g。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 鮮血瓊脂平板、TSB培養(yǎng)基，廣州迪景微生物科技有限公司；細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增試劑盒，北京天根生化科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；通用細(xì)菌采樣管，友康恒業(yè)生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 體細(xì)胞分析儀,Fossomatic Minor；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；恒溫?fù)u床，上海一恒科技有限公司；Sorvall Legend XT/XF 低溫高速離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SimpliAmp PCR儀，美國(guó)ABI公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 將70頭奶牛隨機(jī)分為試驗(yàn)組(36頭)和對(duì)照組(34頭)。每個(gè)感染乳區(qū)注入3 g復(fù)方阿莫西林乳房注入劑，每12 h注射1次，連續(xù)給藥3 d。

1.2.2 奶樣采集 用溫水洗滌乳房后，用750 mL/L酒精擦洗進(jìn)行消毒，采樣前棄掉前段奶樣。分別在用藥前、停藥后7 d(±1 d)和停藥后14 d(±2 d)無(wú)菌采集單個(gè)患病乳區(qū)的奶樣。每個(gè)患病乳區(qū)分別采集兩份奶樣至10 mL和20 mL無(wú)菌采樣管中，標(biāo)記后放入4 ℃采樣箱中保存，當(dāng)日進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)(somatic cell counts，SCC)測(cè)定。

1.2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 將采集的奶樣充分搖勻，吸取100 μL涂布于血平板，同時(shí)吸取50 μL至TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，分別置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱和搖床中，培養(yǎng)18 h～48 h。將血平板中單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，對(duì)未生長(zhǎng)菌落者，取奶樣于TSB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，再用血平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后仍未長(zhǎng)菌的，即可認(rèn)為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

（2）加快客運(yùn)碼頭建設(shè)，建成與杭州市國(guó)家級(jí)旅游城市地位相協(xié)調(diào)的特色客運(yùn)碼頭。推動(dòng)實(shí)施運(yùn)河水陸交通、富陽(yáng)鹿山、桐廬灘頭、建德姚塢和城東等五個(gè)水上集散中心的建設(shè)，以及桐廬旅游碼頭及?？奎c(diǎn)，建德風(fēng)月軒、梅城七廊廟、乾潭、黃饒、嶺后，淳安界首、石林、東北湖區(qū)旅游碼頭，臨安青山湖、柳溪江等旅游客運(yùn)碼頭的建設(shè)。

取純化后的菌液，進(jìn)行革蘭氏染色，然后鏡檢。并提取菌液基因組DNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增16SrDNA，將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行同源比對(duì)，鑒定細(xì)菌種類。

1.2.4 體細(xì)胞計(jì)數(shù) 將奶樣進(jìn)行SCC。比較用藥前、停藥后7 d±1 d和14 d±2 d的變化。

1.2.5 療效評(píng)價(jià) 在用藥前、停藥后7 d±1 d和14 d±2 d分別觀察患牛乳房外觀和乳汁性狀的變化。并統(tǒng)計(jì)治愈率、有效率及總有效率。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

治愈：若患病乳區(qū)紅、腫、熱、疼痛等臨床癥狀完全消失，乳汁顏色以及性狀均恢復(fù)正常，在治療前檢出的病原微生物在治療后未檢出，SCC在75×104個(gè)/mL以下則可判定為對(duì)該病原微生物引起的乳房炎治愈。

有效：患病乳區(qū)臨床癥狀減輕或消退，病原微生物在治療后仍被檢出，SCC明顯下降判為對(duì)該病原微生物引起的乳房炎有效。

無(wú)效：若患病乳區(qū)臨床癥狀未得到改善甚至病情加重，在治療后病原微生物仍被檢出或乳汁中SCC下降不顯著，視為無(wú)效。計(jì)算公式如下：

治愈率=治愈數(shù)/總數(shù)×100%

有效率=有效數(shù)/總數(shù)×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Microsoft Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)與卡方(χ2)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物治療前后乳汁中的病原菌檢測(cè)結(jié)果

細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果如表1和表2所示，用藥前采集的70份奶樣中有58份奶樣檢出細(xì)菌，細(xì)菌總檢出率為82.86%，試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)菌檢出率分別為86.11%(31/36)和79.41%(27/34)。該牛場(chǎng)分離的病原菌主要為鏈球菌(40.63%)、葡萄球菌(31.25%)、大腸埃希氏菌(26.15%)、巨型球菌(1.56%)。停藥后14 d，試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)病原菌的總清除率分別為94.12%和93.55%。試驗(yàn)組對(duì)無(wú)乳鏈球菌、巴黎鏈球菌、乳房鏈球菌、馬胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和巨型球菌的清除率均為100%，大腸埃希氏菌為88.89%，豬葡萄球菌為50%。對(duì)照組對(duì)無(wú)乳鏈球菌、巴黎鏈球菌、乳房鏈球菌、豬葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的清除率均為(100%)，大腸埃希氏菌為87.5%，馬胃葡萄球菌為75%。

表1 用藥前后牛奶樣品中細(xì)菌的變化

2.2 藥物治療前后SCC檢測(cè)結(jié)果

用藥前試驗(yàn)組和對(duì)照組的SCC均遠(yuǎn)高于75×104個(gè)/mL，停藥后7 d、14 d后兩組所采集的奶樣中SCC明顯下降(表3)，說(shuō)明兩組均能達(dá)到治愈標(biāo)準(zhǔn)。

表3 各試驗(yàn)組用藥前后乳汁體細(xì)胞數(shù)

2.3 臨床治療效果

由表4可見(jiàn)，停藥后14d，試驗(yàn)組治愈率和總有效率分別為58.3%(21/36)、88.9%(32/36)；對(duì)照組分別為61.8%(21/34)、85.3%(29/34)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的治愈率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，試驗(yàn)組的總有效率同樣無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表4 試驗(yàn)藥物與對(duì)照藥物治療CM臨床效果統(tǒng)計(jì)

3 討論

BM是危害奶牛健康的重要疾病之一，由于引起B(yǎng)M的致病因素多且病原菌種類復(fù)雜，導(dǎo)致其難以得到根治[8]。BM的發(fā)生常與病原微生物感染、環(huán)境因素及飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)绕渌蛩赜嘘P(guān)[9-10]。使用抗生素進(jìn)行治療可以有效控制BM的發(fā)生。阿莫西林是臨床上治療BM的常用藥物之一，但由于長(zhǎng)期使用或使用不當(dāng)出現(xiàn)一定的耐藥性[7]。因此，將阿莫西林、舒巴坦鈉及潑尼松龍聯(lián)合制備為復(fù)方阿莫西林乳房注入劑。

本試驗(yàn)研究了復(fù)方阿莫西林乳房注入劑對(duì)CM的治療效果。臨床上通常以奶牛的精神狀態(tài)、食欲、產(chǎn)奶量及乳房和乳汁肉眼可見(jiàn)的臨床指標(biāo)作為BM的療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。但僅通過(guò)肉眼觀察臨床癥狀消失即評(píng)判為臨床治愈，假陰性率過(guò)高，部分泌乳期奶牛會(huì)復(fù)發(fā)BM，這與乳汁中細(xì)菌沒(méi)有完全清除有一定關(guān)系[11]。停藥后14 d，試驗(yàn)用藥和對(duì)照用藥對(duì)病原菌的總清除率為94.12%和93.55%。說(shuō)明兩種藥物對(duì)引起該牛場(chǎng)BM的主要病原菌(大腸埃希氏菌、葡萄球菌和鏈球菌)具有較好的清除作用。此外，研究表明乳汁SCC與BM的發(fā)生呈正相關(guān)，SCC也是評(píng)價(jià)奶牛乳房感染程度的重要指標(biāo)之一。SCC結(jié)果顯示，兩組在用藥前后均顯著下降，且兩組間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明兩種試驗(yàn)用藥均能夠改善由乳房炎引起的乳汁SCC升高。臨床結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的臨床治愈率分別為58.3%和61.8%，總有效率分別為88.9%和85.3%。說(shuō)明了試驗(yàn)用藥和對(duì)照用藥兩組臨床療效相當(dāng)。

葡萄球菌與大腸埃希氏菌是導(dǎo)致食源性中毒病和引起B(yǎng)M的主要病原菌，而且乳汁中的營(yíng)養(yǎng)成分與pH值適宜多種細(xì)菌的生長(zhǎng)[12]。β內(nèi)酰胺類抗生素的錯(cuò)誤使用導(dǎo)致了臨床耐藥菌分離率的增加[7]。配方中舒巴坦是一種β內(nèi)酰胺酶抑制劑，可有效抑制多種產(chǎn)A類β內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌，增強(qiáng)阿莫西林對(duì)耐藥菌的抗菌效果[13]，達(dá)到更好的臨床治效果。

復(fù)方中添加抗炎藥潑尼松龍配伍阿莫西林使用來(lái)提高治療效果。在乳房炎的炎癥期間，主要由乳腺上皮細(xì)胞組成的血-乳屏障失去完整性，血液與乳汁之間的梯度無(wú)法維持?？寡姿幍氖褂秒m然無(wú)法阻止血-乳屏障被破壞，但有研究證明抗炎藥的使用可以幫助重建屏障的完整性，促進(jìn)乳房炎癥的恢復(fù)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)抗炎藥物的使用可以有效地減少與疾病和疼痛相關(guān)的行為，并顯著改善牛的福利[14]。在另一項(xiàng)乳房炎的自然感染研究中，同樣證實(shí)了抗菌藥與抗炎藥的配伍使用可以通過(guò)減輕與乳房炎乳腺炎引起的疼痛和不適，促進(jìn)輕度或中度乳房炎的恢復(fù)[15]。

復(fù)方阿莫西林乳房注入劑可以通過(guò)舒巴坦鈉增強(qiáng)阿莫西林對(duì)臨床菌株的抑制作用和潑尼松龍減輕乳房炎癥反應(yīng)和相關(guān)疼痛反應(yīng)來(lái)更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)CM的治療效果。

綜上所述，鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方阿莫西林乳房注入劑與對(duì)照用藥的臨床療效相近，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明本試驗(yàn)中復(fù)方阿莫西林乳房注入劑(試驗(yàn)用藥)能夠有效治療泌乳期奶牛臨床型乳房炎，可以進(jìn)一步推廣與應(yīng)用。