姜興粲，李 冰，張繼瑜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730050)

沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)是繼恩諾沙星之后又一新的動(dòng)物專(zhuān)用藥，對(duì)多種細(xì)菌均有較強(qiáng)抑殺作用，是臨床上常用的廣譜抗菌藥。為提高沙拉沙星的溶解度，可用環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)做輔料制成包合物制劑。環(huán)糊精包合物微膠囊是通過(guò)分子間弱相互作用形成的主客分子體系，是提高難溶性藥物溶解度和生物利用度的一種有效技術(shù)[1-8]。環(huán)糊精是一種環(huán)狀低聚糖，呈截短的錐形，可以在不同程度上包裹具有適當(dāng)分子尺寸和極性的疏水性藥物分子。這種包合物可以提高藥物的化學(xué)穩(wěn)定性、膜滲透性和生物利用度。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)證明可以改善多種藥物的溶解度和溶出度，如紫杉醇包合物制劑[1-7]。常用的環(huán)糊精有α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，它們分別由6個(gè)、7個(gè)和8個(gè)葡萄糖單元組成。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrins，β-CD)及其衍生物是藥物制劑中常用的主要賦形劑[1-8]。

響應(yīng)面方法(Response surface method，RSM)用于建立經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停赏ㄟ^(guò)統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)將所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)減到最少，還用于研究多個(gè)單因素之間的交互作用。優(yōu)化沙拉沙星/β-環(huán)糊精(SAR/β-CD)包合物制備條件的常規(guī)方法是通過(guò)單因素試驗(yàn)進(jìn)行的，每次考察一個(gè)因素，既費(fèi)時(shí)又不能預(yù)測(cè)不同條件下的結(jié)果,所以需要利用一定的數(shù)學(xué)技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)試驗(yàn)[9-12]。近年來(lái)，RSM已被用于許多生物技術(shù)過(guò)程，包括培養(yǎng)條件的優(yōu)化和酶的生產(chǎn)。目前，關(guān)于其微膠囊制備的報(bào)道很少[9-12]。本文采用RSM優(yōu)化制備工藝來(lái)獲得更精確的試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)制備的沙拉沙星/β-環(huán)糊精(SAR/β-CD)包合物進(jìn)行表征和粒度測(cè)定以及體外釋放度研究，以期為沙拉沙星的應(yīng)用提供參考。

1 材料及方法

1.1 藥品

沙拉沙星(分子量385.3 g/moL，含量>98%，批號(hào)20171022)，廣州楊葉生物科技有限公司產(chǎn)品；β-環(huán)糊精(β-CD，分子量1 135 g/moL，批號(hào)20171216)，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；沙拉沙星粉劑(批號(hào)20180311)，安徽奧力欣生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇(99.98%，批號(hào)20171227)，F(xiàn)isher Chemical公司產(chǎn)品；所有使用的試劑均為AR級(jí)。

1.2 主要儀器

溶出儀(USPII型)，PHARMA公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)(RV8型)，Edwards有限公司產(chǎn)品；高效液相分析系統(tǒng)(1290InfinityП型)，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡(JSM-6701型)，日本電子光學(xué)有限公司產(chǎn)品；粒度分析儀(Mastersizer 2000型)，Malven Instruments科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 SAR/β-CD包合微膠囊的制備

1.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝 采用響應(yīng)面法(RSM)中的Box-Behnken設(shè)計(jì)法優(yōu)化微膠囊的制備條件，利用RSM分別建立3個(gè)模型，根據(jù)綜合評(píng)分的響應(yīng)值來(lái)優(yōu)化微膠囊的制備條件。這些模型可以為制備工藝提供更可靠的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，從而獲得所需的目標(biāo)包合物微膠囊。用響應(yīng)面分析法研究了微膠囊包合率伴隨溫度、攪拌速度和攪拌時(shí)間的變化[1-5,13-14]。采用3因素3水平設(shè)計(jì)的響應(yīng)面模型研究自變量的影響：攪拌時(shí)間(x1)從3 h到5 h；溫度(x2)從40℃到60℃；攪拌速度(x3)從200 r/min到400 r/min[16]。3個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的指代意義見(jiàn)表1所示。

表1 總結(jié)

1.3.2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 綜合評(píng)分總分100分，攪拌時(shí)間分別為3 h、4 h和5 h，總分為9分，占比9%，攪拌時(shí)間評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：5 h，得3分；4 h，得6分；3 h，得9分。轉(zhuǎn)速分別為200 r/min、300 r/min和400 r/min，總分9分，占比9%。轉(zhuǎn)速評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為400 r/min，3分；轉(zhuǎn)速為300 r/min，6分；轉(zhuǎn)速為200 r/min，9分。攪拌溫度分別為40℃、50℃和60℃，總分為9分，占比9%。攪拌溫度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為60℃，得3分；50℃，得6分；40℃，得9分。在同一處方中，當(dāng)原料藥與β-環(huán)糊精的摩爾比相同時(shí)，每克包合物微囊中原藥含量越高，包合率越高[5,14,17-18]。

包合率=(包合物中SAR質(zhì)量/添加的SAR質(zhì)量)×100%

包合率反映了β-環(huán)糊精對(duì)沙拉沙星的包埋效果，總分73分，占比73%。包合率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為包合率<70%，得24分；70%<包合率<90%，得48分；90%<包合率，得73分[6,7,20-23]。

1.4 冷凍干燥

將完成包合作用后的溶液放入-80℃的冰箱中冷凍過(guò)夜，然后迅速放入冷凍干燥機(jī)中，干燥48 h后取出[24]。

1.5 HPLC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將參比物質(zhì)稱(chēng)量適量，用0.1 moL/L氫氧化鈉溶液溶解，放入容量為50 mL的容量瓶中，加入流動(dòng)相定容，制成沙拉沙星的質(zhì)量濃度為0.099 4 g/L的參比溶液。制備質(zhì)量濃度分別為9.94、19.88、29.82、39.76、49.70、59.64、69.58、79.52和89.46 mg/L的一系列參比溶液，用于液相色譜測(cè)定。以峰面積(y，MAU*s)為縱向坐標(biāo)，以SAR質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；厥章蕦?shí)驗(yàn)分別制備不同濃度的參比溶液(n=6)，過(guò)濾后注入液相色譜儀。

1.6 掃描電子顯微鏡(SEM)

使用雙面膠帶分別將SAR、β-CD和SAR/β-CD包合物及物理混合物樣品粉末預(yù)先固定在黃銅短管上并通過(guò)薄金涂層導(dǎo)電，在5.0 kV工作電壓下觀察樣品形態(tài)[8,25,26]。

1.7 粒徑檢測(cè)

將SAR/β-CD包合物微囊與10 mL蒸餾水在25℃下混合制備樣品懸浮液，進(jìn)行SAR/β-CD包合微膠囊的粒度大小分布測(cè)定，樣品一式3份[27]。

1.8 體外溶出度研究

在50 r/min的轉(zhuǎn)速下，溶出介質(zhì)(pH 7.4的PBS緩沖液)900 mL中對(duì)物理混合物、SAR普通粉劑和SAR/β-CD包合物微囊進(jìn)行體外溶出度實(shí)驗(yàn)。以預(yù)定的時(shí)間間隔(0、5、10、15、25、30、35、45、50、60、80、100、130、160和190 min)取樣，然后用新鮮溶解介質(zhì)替換。用驗(yàn)證的HPLC方法在280 nm處對(duì)溶出樣品進(jìn)行分析[7,13,21-23]。

2 結(jié)果

2.1 HPLC條件

色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動(dòng)相為乙腈-2%四丁基溴化銨(13∶87，v/v)體系，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量：5 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y(MAU*s)=34.66x(μg/mL)-15.867，檢測(cè)限為0.004 μg/mL(S/N≥3)，定量限為0.066 μg/mL(S/N≥10)，其中y為SAR的峰面積，x為SAR的質(zhì)量濃度。高濃度(89.46 μg/mL)、中濃度(59.64 μg/mL)和低濃度(29.82 μg/mL)的平均回收率分別為100.21%、99.17%和101.67%，此方法高效可行。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

由表2中的數(shù)據(jù)及多次實(shí)驗(yàn)篩選驗(yàn)證得到的最佳制備工藝參數(shù)為沙拉沙星(0.01 moL)和β-環(huán)糊精(0.02 moL)混合液以300 r/min的攪拌速度，在50℃溫度下攪拌4 h。由響應(yīng)面綜合評(píng)分測(cè)試和回歸方差分析(表2和表3)顯示，溫度(x1)、速度(x2)和時(shí)間(x3)具有顯著性差異(P<0.05)，圖1 為各個(gè)變量與綜合評(píng)分的3D響應(yīng)面和等高線圖，與表3中的回歸方差分析相互印證。

a，b.速度和時(shí)間；c，d.速度和溫度；e，f.溫度和時(shí)間

表2 響應(yīng)面測(cè)試表

表3 包合過(guò)程回歸方差分析

2.3 包合率測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物的平均包合率為90.33%(表4)，β-CD對(duì)SAR產(chǎn)生了良好的包合效果，既符合《中國(guó)獸藥典》(2015版)的規(guī)定也滿足了生產(chǎn)和應(yīng)用的要求。

表4 包合率

2.4 掃描電鏡表征結(jié)果

結(jié)果顯示，純沙拉沙星呈現(xiàn)出大小不同的小顆粒，如圖2(C)；β-環(huán)糊精顯示不規(guī)則顆粒聚集，見(jiàn)圖2(B)；物理混合物與原藥自由分子晶體有一些相似之處，顯示了兩種晶體組成，見(jiàn)圖2(A)；SAR/β-CD包合物微膠囊呈現(xiàn)為致密均勻的塊狀結(jié)構(gòu)，包合作用后兩種成分的原始形態(tài)消失了，它不同于β-環(huán)糊精和沙拉沙星的大小和形狀，如圖2(D)所示。

圖2 物理混合物(A)、β-CD(B)、SAR(C)和包合物微囊(D)的掃描電鏡圖像

2.5 粒徑檢測(cè)結(jié)果

粒徑檢測(cè)結(jié)果表明，制備的3份SAR/β-CD包合微膠囊的平均粒徑約為1.0 μm(圖3)，分布均勻且相對(duì)集中，符合《中國(guó)獸藥典》(2015版)的規(guī)定。

圖3 粒度檢測(cè)

2.6 體外釋藥規(guī)律

沙拉沙星和β-環(huán)糊精的物理混合物、沙拉沙星普通粉劑和沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物微囊的溶出曲線如圖4所示。在PBS緩沖液中SAR/β-CD包合物微囊的累積溶出度明顯高于物理混合物和沙拉沙星粉劑。對(duì)于SAR/β-CD包合物，在前5 min累積溶出度超過(guò)60%，60 min后累積溶出度達(dá)到97%左右并保持穩(wěn)定，而對(duì)于沙拉沙星和β-環(huán)糊精的物理混合物，前5 min累積溶出度僅為34.1%，60 min后累積溶出度達(dá)到63%左右并保持穩(wěn)定。而沙拉沙星粉劑在前5 min的累積溶出率僅為51.9%，60 min后累積溶出率達(dá)到74.4%左右并保持穩(wěn)定。

圖4 SAR/β-CD包合物微囊(●)、粉末(▲)和物理混合物(■)的體外釋放度

3 討論

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物的制備方法[10-12]，優(yōu)化后的條件為SAR(0.01 moL)和β-CD(0.02 moL)混合液以300 r/min的轉(zhuǎn)速，在50℃下攪拌4 h，此工藝安全、高效，對(duì)環(huán)境無(wú)污染。掃描電子顯微鏡表征實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)出沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物不同于原藥和輔料的形貌，證明了SAR/β-CD包合物微囊的形成[4-8]。粒徑試驗(yàn)表明，水溶液中SAR/β-CD包合物微囊的平均粒徑為1.0 μm且呈正態(tài)分布，與張良珂對(duì)柚皮素的磺基丁醚-β-環(huán)糊精/殼聚糖納米粒子的研究結(jié)論一致[27]。在響應(yīng)面法優(yōu)化后的參數(shù)下，沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物的平均包合率為90.33%，可以滿足工業(yè)生產(chǎn)與臨床使用的要求。以pH 7.4的PBS緩沖液為溶出介質(zhì)的體外溶出試驗(yàn)表明，SAR/β-CD包合物微囊的累計(jì)溶出率為97%，明顯高于物理混合物和沙拉沙星普通粉劑63%和74%的溶出率，這與同類(lèi)制劑研究中納雷什·德瓦薩里對(duì)厄洛替尼與磺丁基醚-環(huán)糊精包合物的研究[22]和阿努拉格·洛達(dá)卡對(duì)氯硝柳胺-環(huán)糊精包合物的研究[28]取得了相似的結(jié)論,文中累積溶出量按標(biāo)示量計(jì)算結(jié)果不低于規(guī)定限度，符合《中國(guó)獸藥典》(2015版)的規(guī)定。目前，上市的喹諾酮類(lèi)藥劑主要為普通粉劑，仍存在溶解度較低的缺點(diǎn)。本文中SAR/β-CD包合物微囊的成功制備對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的推廣應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。