劉 凡，郭 磊，陳秀紅，邊海霞，郭亞男，姜肖軍，何生虎*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏銀川 750021)

雞滑液支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)是可以引起雞亞臨床型上呼吸道感染的一種重要禽類病原體[1]。雞滑液支原體病又名雞滑液支原體感染，是由MS引起的雞、鴨等禽類一種以關(guān)節(jié)有膿性滲出物的滑膜炎、腱鞘炎、關(guān)節(jié)腫大及跛足為主要特征的禽類傳染病。雞群感染后會出現(xiàn)明顯的精神沉郁、喜臥，肉雞主要表現(xiàn)為生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率低，蛋雞則會出現(xiàn)產(chǎn)蛋率、蛋品質(zhì)和孵化率下降，且在多項(xiàng)研究中表明，雞滑液支原體病還會與禽流感、新城疫病毒和大腸埃希氏菌等在致病力方面有協(xié)同作用，導(dǎo)致雞群死淘率增加，給家禽養(yǎng)殖行業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

從2010年我國南方最先發(fā)生此病開始，短短數(shù)年時(shí)間MS就已經(jīng)成為影響我國家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的最重要疫病之一。國內(nèi)外關(guān)于雞滑液支原體病的預(yù)防治療方案也多以疫苗免疫和抗生素治療為主，但有研究結(jié)果顯示，抗生素藥物和滅活疫苗免疫的聯(lián)合保護(hù)率最好也僅達(dá)到80%[5]。防控MS傳染性疫病最好方案是疫病凈化，其次是疫苗免疫與藥物治療。然而MS的傳染性強(qiáng)且傳播途徑廣泛，不僅可以發(fā)生水平傳播還可以發(fā)生垂直傳播。近年來，全國各地都存在MS感染，從流行情況、飼養(yǎng)環(huán)境、從業(yè)人員水平等多方面而言，凈化的解決方案在我國現(xiàn)階段執(zhí)行難度過大。同時(shí)MS易產(chǎn)生耐藥性，和細(xì)菌相比基因組較小但其某些基因的轉(zhuǎn)換表達(dá)會產(chǎn)生很大的抗原變異?，F(xiàn)依舊僅有澳大利亞等少數(shù)國家有MS溫度敏感型活疫苗的商品應(yīng)用[6]，而國內(nèi)的研究學(xué)者石曉磊等[7]研究發(fā)現(xiàn) MS活疫苗無法保護(hù)已感染的雞群，在免疫后反而會造成更大的經(jīng)濟(jì)損失,這也可能是MS疫苗免疫效果不理想難以防控的重要因素[8]，更是MS僅僅數(shù)年內(nèi)就對我國的家禽養(yǎng)殖行業(yè)造成了巨大損失的一個(gè)重要原因。

在早期報(bào)道的MS體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)中，MS對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及喹諾酮類抗菌藥物敏感[9-10]，藥物治療可以有效降低MS通過蛋傳播，還可以一定程度改善蛋品質(zhì)[11]。然而，隨著抗生素的廣泛使用和濫用，MS對抗生素的耐藥程度也是逐年升高，而治療效果每況愈下。自2006年起，許多國家就開始禁止使用抗生素作為生長促進(jìn)劑，抵制在家禽飼料中添加抗生素產(chǎn)品[12]。同時(shí)，早在2017年6月22日我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部為應(yīng)對動(dòng)物源細(xì)菌耐藥挑戰(zhàn)，提高獸用抗菌藥物科學(xué)管理水平，制定了《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃(2017-2020年)》，更加嚴(yán)格的限制了抗生素的使用。次年8月，我國又首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟，自疫情發(fā)生以來，生豬飼養(yǎng)量急劇下降，肉類供求關(guān)系一度出現(xiàn)失衡。家禽因飼養(yǎng)周期短、飼養(yǎng)成本低等特點(diǎn)，禽類動(dòng)物產(chǎn)品迅速成為了生豬產(chǎn)品的替代者，造成我國市場對禽類肉品和禽蛋的需求大大增加。MS作為目前影響我國家禽飼養(yǎng)最重要是疫病之一，其防控治療就顯得尤為重要。

中草藥作為我國醫(yī)藥史上的一塊瑰寶，有著許多得天獨(dú)厚的優(yōu)越條件。中草藥本身屬于植物，是一種既無抗藥性和耐藥性,也無藥害殘留、無污染的一類天然產(chǎn)品,具有抗病保健、抗毒素、提高機(jī)體免疫力和生產(chǎn)性能、調(diào)整胃腸機(jī)能等特點(diǎn)[13]。近年來，中藥在許多動(dòng)物疾病治療中做出了很大貢獻(xiàn)。一些國內(nèi)研究者在此方面做了大量工作，王春元等[14]研究表明，中藥果根素對雞毒支原體有治療效果，但還未發(fā)現(xiàn)中藥對雞滑液支原體病治療的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)依據(jù)中獸醫(yī)理論及所在實(shí)驗(yàn)室中藥治療動(dòng)物疫病的研究基礎(chǔ)，結(jié)合雞滑液支原體臨床癥狀和病理特征，選取大黃、黃連、金銀花等8味中草藥混合制成超微粉對雞滑液支原體病雞進(jìn)行治療，探究中藥對雞滑液支原體病的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 大黃、黃連、金銀花、車前子、黨參等8味中藥，購自亳州金勺堂中藥飲片有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及菌株 30只雞滑液支原體血清學(xué)抗體檢測為陰性的28日齡海蘭褐雛雞，由寧夏某蛋雞孵化公司提供；雞滑液支原體分離株G-52為攻毒株，由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要試劑 改良的Frey氏固、液培養(yǎng)基，北京中海生物科技有限公司產(chǎn)品；IDEXX雞滑液支原體抗體的酶免疫檢測試劑盒，美國愛德士生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 恒溫?fù)u床(QYC-200)，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀 S1000，Thermal Cycler伯樂公司產(chǎn)品；凝膠成像儀(Universal Hood II)，BIO-RAD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(scientific MULTLISKAN MK3)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雞滑液支原體病病理模型的建立 將實(shí)驗(yàn)室保存的雞滑液支原體分離株G-52經(jīng)改良的Frey液體培養(yǎng)基復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到1×108CCU/mL，作為接種菌液。30只28日齡雛雞隨機(jī)分為治療組、陽性對照組(以下簡稱對照組)和空白組3組，10只/組。治療組和對照組通過鼻腔滴入菌液攻毒，進(jìn)行病理模型的復(fù)制，劑量按0.5 mL/只/d,連續(xù)攻毒3 d[2,7]，空白組按0.5 mL/只/d劑量生理鹽水做相同處理，連續(xù)3 d。

1.2.2 臨床觀察 攻毒后每天觀察各組雞群采食、飲水量、精神狀態(tài)及肢體等情況，隔天記錄雞群體溫，每隔7 d記錄雞只體重、翅下靜脈采血分離血清。

1.2.3 中藥制備 將配伍組方的8種中藥按不同份額配比進(jìn)行超微粉碎，粒徑在15～20目混勻備用。

1.2.4 中藥治療試驗(yàn) 治療組和對照組雞群在雞滑液支原體病病理模型建立的第21 天(雛雞49日齡)時(shí)，雞群整體羽毛蓬松，喜臥、精神沉郁采食量降低、眼瞼腫脹、關(guān)節(jié)腫大站立不穩(wěn)。出現(xiàn)臨床癥狀后對試驗(yàn)組進(jìn)行復(fù)方中藥治療，每天早晚各投喂1次，每次1 g/只,連續(xù)投喂7 d。中藥治療后觀察7 d。

1.2.5 病理剖檢對比 試驗(yàn)第35 天(雛雞64日齡)分別對治療組、對照組和空白組雞進(jìn)行解剖檢查，觀察雞內(nèi)臟組織器官的病理變化。

1.2.6 病原分離驗(yàn)證 第35 天采集各組雞咽拭子、跗關(guān)節(jié)內(nèi)膿性分泌物分別接種MS固體和液體培養(yǎng)基中，在固體培養(yǎng)基看菌落生長情況。在液體培養(yǎng)基按1∶10倍接種，37℃培養(yǎng)2 d后，取3 mL培養(yǎng)液,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的MS通用引物中雞滑液囊支原體的基因序列(MS-F:5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；MS-R:5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′)合成引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳分析后觀察擴(kuò)增的特異性目的片段[15]。

1.2.7 抗體水平檢測 按說明書方法將采集的血清進(jìn)行滑液囊支原體抗體檢測，計(jì)算S/P值(S/P≥0.5為陽性；S/P<0.5為陰性)判斷MS抗體的水平。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 不同組的雞群體溫、體重和抗體水平檢測結(jié)果采用SAS 8.2軟件、Graphpad Prism 8和EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 體溫變化

治療組和對照組通過菌液滴鼻感染攻毒后整體出現(xiàn)體溫升高的情況(圖1)，在試驗(yàn)第21天對治療組雞進(jìn)行中藥治療后雖然未恢復(fù)到與空白組統(tǒng)一水平，但雞群體溫有逐步下降趨勢。

圖1 試驗(yàn)階段各個(gè)組雞體溫變化趨勢

2.2 體重變化

每隔7 d對各組雞稱重直至試驗(yàn)結(jié)束，計(jì)算平均增重情況。結(jié)果表明，治療組和對照組在人工感染后，雞群平均凈重均低于空白組，隨著周齡增加，治療組對照組與空白組體重差異越來越大。采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，自42日齡后直至試驗(yàn)結(jié)束，治療組對照組與空白組的體重差異顯著(P<0.05)，但在49日齡進(jìn)行治療1周后，治療組增重明顯高于對照組(P<0.05)，具體結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)各組雞體重的變化

2.3 抗體水平變化

攻毒感染前對3組雞采血分離血清，檢測MS抗體水平為陰性，隨后每隔7 d對各組雞采血分離血清，檢測MS抗體水平，直至試驗(yàn)結(jié)束，計(jì)算S/P值(S/P≥0.5為陽性)，判斷雞群感染MS情況。結(jié)果表明，治療組和對照組在人工感染雞滑液支原體后，雞群抗體水平S/P值明顯升高，MS抗體水平有顯著升高?？瞻捉M因未進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)，抗體水平檢測一直保持陰性。

圖2 試驗(yàn)各組雞MS抗體水平變化圖

2.4 臨床癥狀

空白組雞從試驗(yàn)開始到結(jié)束整個(gè)過程中未出現(xiàn)任何異常情況，精神狀態(tài)良好，飲水采食都一直保持正常。治療組和對照組雞在攻毒后第8 天(雛雞37日齡)出現(xiàn)呆滯喜臥，采食量減少，雞冠顏色變淺，在攻毒后第15 天出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，不愿站立、行動(dòng)緩慢，雞冠肉髯蒼白，個(gè)別雞出現(xiàn)張口呼吸和呼嚕聲。在攻毒后第20 天，治療組和對照組雞全部出現(xiàn)精神沉郁，羽毛松亂，雞跗關(guān)節(jié)腫脹，按壓有波動(dòng)感，個(gè)別雞出現(xiàn)行動(dòng)障礙。

2.5 中藥治療結(jié)果

人工感染MS后，治療組在攻毒后第21 天開始通過口服方式投喂復(fù)方中藥進(jìn)行治療，經(jīng)過7 d治療后，雞冠顏色由蒼白色轉(zhuǎn)為紅色，精神狀態(tài)活潑，采食量有所提高，站立不穩(wěn)的癥狀消失。對照組沒有進(jìn)行任何治療，在攻毒后第22天有1只雞發(fā)生死亡，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方中藥對雞滑液支原體病治療效果

2.6 剖檢結(jié)果

剖檢可見治療組和對照組雞均存在嚴(yán)重消瘦情況，胸背部肌肉萎縮、龍骨突出。對照組有輕微彎曲癥狀，雞趾附關(guān)節(jié)腫脹，滑膜組織關(guān)節(jié)液有膿性滲出物，滲出物呈黏液狀，氣管出現(xiàn)環(huán)狀出血，肝臟輕微腫大，顏色發(fā)黃、質(zhì)脆邊緣變鈍。治療組關(guān)節(jié)液清亮、肝臟顏色鮮紅，邊界清晰，其他組織臟器均未見明顯病理特征。

2.7 病原分離驗(yàn)證

對采集的治療組、對照組和空白組的關(guān)節(jié)液進(jìn)行分離培養(yǎng)，本文參照周云峰等[16]、羊揚(yáng)等[17]研究方法，利用GenBank中收錄的雞滑液支原體WVU 1853(ATCC 25204)株(GenBank登陸號：N-R044811)VlhA基因序列合成引物進(jìn)行擴(kuò)增，以實(shí)驗(yàn)室收藏菌株為陽性對照，有效率陽性對照與對照組產(chǎn)物均得217 bp大小的片段(圖3)。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；2.治療組；3.空白組；4.對照組；5.陰性對照；6.陽性對照

3 討論

通過分析本試驗(yàn)過程中各組雞體溫、體重、臨床癥狀、病理變化、復(fù)方中藥治療的效果、病原分離驗(yàn)證等，驗(yàn)證了復(fù)方中草藥制劑對雞滑液支原體病有確切的治療效果。試驗(yàn)首先成功復(fù)制出雞感染滑液支原體病的動(dòng)物模型，試驗(yàn)結(jié)果與張鑫等[2]和丁美娟等[18]兩組人工感染復(fù)制的病理模型有高度一致性，發(fā)病雞臨床癥狀雞冠蒼白，跛行、采食量下降，雞群出現(xiàn)羽毛粗亂，大部分雞關(guān)節(jié)、爪塾腫脹。人工感染3周后(雛雞42日齡)，試驗(yàn)組體重(545.4 g±14.93 g)和對照組體重(546.4 g±15.47 g)與空白組雞體重(574.5 g±11.91 g)出現(xiàn)差異顯著情況，說明雞滑液支原體病雞會影響采食，甚至降低飼料轉(zhuǎn)化率，從而會降低雞增重速度。中藥治療1周后，試驗(yàn)組平均體溫下降趨勢明顯，基本與空白組體溫一致。用中藥治療后試驗(yàn)組雞群平均增重的提高明顯優(yōu)于對照組，試驗(yàn)過程體溫變化、平均增重與張鑫等[2]和丁美娟等[5]對禽滑液支原體相關(guān)研究的結(jié)果一致。

整個(gè)試驗(yàn)過程中，雛雞未進(jìn)行過雞滑液支原體的疫苗免疫，治療組和對照組僅進(jìn)行了雞滑液支原體菌株的攻毒處理后，血清樣品S/P值大于0.5判定為抗體陽性且持續(xù)增高，說明治療組和對照組雞群MS抗體水平一直在上升，存在雞滑液支原體感染。治療組配合中藥治療后抗體水平有所下降，原因可能是治療后病原刺激減弱從而影響了抗體水平的升高；對照組因?yàn)闆]有進(jìn)行治療，抗體一直保持較高水平；空白組雞除未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，其他飼養(yǎng)條件均不變，一直保持MS血清學(xué)抗體檢測陰性，進(jìn)一步驗(yàn)證了病理模型復(fù)制的成功，也為試驗(yàn)有效性做了進(jìn)一步支撐。

在病理剖檢過程中，試驗(yàn)組經(jīng)過治療后剖檢未發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)有滲出物且肝臟呈紅棕色，對照組雞關(guān)節(jié)腫大且有黏稠黃色滲出物，肝臟呈現(xiàn)土黃色，后期MS的病原分離檢測中，試驗(yàn)組也未分離檢測到MS病原，對照組分離檢測到MS病原，從臨床治療檢驗(yàn)的角度都說明了中藥確實(shí)對雞滑液支原體病有良好的治療效果。治療試驗(yàn)組體溫下降、體重增加且剖檢未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化，主要是復(fù)方中藥中有涼血解毒、清熱燥濕等功效藥物，同時(shí)還有補(bǔ)中益氣、健脾益肺等功能性藥物補(bǔ)充，使得試驗(yàn)組雞群發(fā)熱情況得到有效控制，臨床指征也有了明顯改觀。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中草藥制劑對雞滑液支原體病治療具有可靠性和應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)結(jié)合中獸醫(yī)理論指導(dǎo)特意選擇的8種中藥，大多具有抗菌消炎和增強(qiáng)機(jī)體免疫作用，對雞滑液支原體臨床癥狀有選擇性和針對性治療效果[19]，組成的復(fù)方制劑進(jìn)行雞滑液支原體病的實(shí)驗(yàn)室治療，表觀的臨床有效率達(dá)100%，從病原學(xué)的角度，在治愈后的試驗(yàn)雞也未分離出雞滑液支原體病原，治療效果達(dá)到了預(yù)期試驗(yàn)效果，雖然復(fù)方中藥治療的內(nèi)在機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，中藥治療的效果與抗生素治療的效果未進(jìn)行相關(guān)的對比試驗(yàn)，但對實(shí)際生產(chǎn)中雞滑液支原體病的防控提供了新的思路，尤其是為感染發(fā)病后雞群的治療提供了參考。