史 琳 焦緒棟 王程軍

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003；2 金鑼醫(yī)院 山東 臨沂 276036；3 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所 山東 煙臺 264000

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)為常見慢性婦科疾病之一，也是不孕不育的主要原因之一，多造成卵巢囊腫[1]。EMS的主要臨床癥狀為慢性非月經(jīng)疼痛、急性骨盆疼痛、呼吸困難、陰道出血等[2]。EMS的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前認(rèn)為是由環(huán)境因素或營養(yǎng)不良造成的一種自身免疫性疾病或激素性疾病[3]。子宮內(nèi)膜受到多種內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)，主要包括雌激素和黃體酮，激素分泌失衡參與子宮內(nèi)膜癥的發(fā)生和發(fā)展[4]。促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)共同調(diào)節(jié)卵泡激素的分泌。EMS患者性腺軸功能異常，對激素的敏感性明顯減低。EMS患者的氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡在其發(fā)病過程中起到?jīng)Q定性作用，另外，局部盆腔炎癥反應(yīng)失衡，造成炎癥因子大量積累也是發(fā)病機(jī)制之一[5-6]。EMS患者外周血中氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯增加，如熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和脂質(zhì)過氧化氫物等[7]，其中MDA增加顯著，在EMS的診斷中具有重要意義[8]。EMS患者腹腔內(nèi)多種炎癥因子分泌增加，如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等，從而增加血管的通透性和組織粘連[9-10]。因此，重塑炎癥反應(yīng)和氧化反應(yīng)平衡是改善EMS癥狀的關(guān)鍵。臨床上多以藥物和手術(shù)治療EMS為主，但是存在對機(jī)體損傷大、懷孕率低、復(fù)發(fā)率高等缺陷，因此尋找簡便、快捷、不易復(fù)發(fā)的新型治療手段迫在眉睫。

海藻多糖是天然的活性物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性和藥用價值。近年來，海藻多糖的藥理學(xué)被廣泛研究，如抗病毒[11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13]和降血脂[14]等。海藻多糖可以顯著抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠IL-6炎癥因子的分泌[15]。海藻具有軟堅散結(jié)的功效，是中醫(yī)治療EMS的常見用藥。海藻多糖作為海藻的主要活性成分其對EMS保護(hù)作用尚未見報道。本研究通過制作大鼠EMS疾病模型，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)評估海藻多糖對EMS的治療程度，為開發(fā)新型的治療EMS的藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠，體質(zhì)量為200～220 g，清潔級，由北京華阜康有限公司動物研究中心提供。

1.2 主要試劑 海藻多糖(Sigma公司)，青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)，Rat-FSH Elisa試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)，Rat-LH和Rat-IL-6 Elisa試劑盒(美國R&D公司)，MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，微量移液器和酶標(biāo)儀(Thermo公司)，石蠟切片機(jī)(Leica公司)，和普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS CX3公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及模型的建立 30只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組和海藻多糖高、中、低劑量組共5組，每組各6只。參照J(rèn)ones[16]的造模方法，購買大鼠后喂養(yǎng)1周開始造模，稱量大鼠體質(zhì)量，腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，給藥劑量為0.3 mL/kg，等大鼠完全麻醉后，用橡皮筋把大鼠固定到鼠板上，并用棉簽蘸取碘伏對腹部進(jìn)行消毒處理，用鑷子提起腹壁，用剪刀沿腹中線輕輕剪開腹壁，用棉簽把腸道取出，放到無菌紗布上，尋找到左側(cè)子宮角后，用結(jié)扎線結(jié)扎，并用剪刀取部分子宮組織。然后迅速把組織放入裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，用鑷子去除脂肪后，把內(nèi)膜剪成方形的小方塊，大小約為0.5 cm×0.5 cm，用縫合針把剪好的方形內(nèi)膜與腹壁一起縫合好，再把腹壁縫合好。手術(shù)后4周，再次麻醉大鼠，開腹觀察。子宮內(nèi)膜體積變大到約30 mm3以上，且有血管形成和水腫等病變，可以認(rèn)定造模成功。造模成功后，開始灌胃給藥，低劑量組為150 mg/kg，中劑量組為300 mg/kg，高劑量組為600 mg/kg，空白組和模型組給予等體積的溶劑, 每天給藥1次，連續(xù)給藥兩周后取材。

1.4.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 造模第6周末取材，取材前大鼠禁食8 h，取各組大鼠異位內(nèi)膜組織，用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE染色后, 光學(xué)顯微鏡觀察各組異位內(nèi)膜組織病理學(xué)變化。

1.4.3 血清FSH、LH、MDA和IL-6水平的檢測 造模第6周末取材，取材前大鼠禁食8 h，腹主動脈采血，3 000 rpm離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒的操作說明檢測各組FSH、LH和IL-6的變化，同時檢測各組MDA積累。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察內(nèi)膜病理變化 HE染色后用顯微鏡拍照并觀察各組病理變化，見圖1。對照組內(nèi)膜上皮呈高柱狀或柱狀整齊排列，界限清晰，細(xì)胞核大小適中，形態(tài)規(guī)則，可見核下空泡，間質(zhì)細(xì)胞排列均勻。模型組腺體形態(tài)發(fā)生明顯改變，內(nèi)膜上皮呈現(xiàn)矮柱狀，細(xì)胞核變大，細(xì)胞包漿內(nèi)容物增多，細(xì)胞間質(zhì)增多，細(xì)胞間隙變小，內(nèi)膜增厚。海藻多糖各治療組異位內(nèi)膜均受到不同程度的抑制。低劑量組內(nèi)膜組織萎縮變薄，細(xì)胞呈矮柱狀，排列松散；中劑量組腺體數(shù)目減少，腺腔萎縮，功能層變薄；高劑量組部分大鼠異位內(nèi)膜完全消失，呈劑量依賴性。

圖1 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜的病理變化(HE染色，×400)

2.2 海藻多糖對外周血中LH水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠外周血中LH激素的水平升高(P<0.01)。海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中LH水平，呈劑量依賴性，中劑量組、低劑量組和高劑量組LH水平與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖2。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖2 海藻多糖對外周血中LH水平的影響

2.3 海藻多糖對外周血FSH水平變化的影響 FSH水平也是反映EMS造模是否成功的常用指標(biāo)。同LH一樣，模型組大鼠外周血中FSH激素的水平與對照組相比也升高(P<0.01)。海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中FSH水平，呈劑量依賴性，中劑量組、低劑量組和高劑量組FSH水平與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖3。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖3 海藻多糖對外周血FSH水平的影響

2.4 海藻多糖對外周血中IL-6分泌的影響 模型組大鼠外周血中IL-6的水平與對照組比較升高(P<0.01)；海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中IL-6的水平，呈劑量依賴性，中劑量組、低劑量組和高劑量組IL-6與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖4。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖4 海藻多糖對外周血中IL-6分泌的影響

2.5 海藻多糖對外周血中MDA水平的影響 MDA是脂質(zhì)分子過氧化的產(chǎn)物，檢測各組血清中MDA的水平變化可以反映海藻多糖對氧化應(yīng)激的影響。模型組大鼠外周血中MDA的水平與對照組比較升高(P<0.01)；海藻多糖不同程度地降低大鼠血清中MDA水平，呈劑量依賴性, 中劑量組、低劑量組和高劑量組MDA水平與模型組相比均降低(P<0.05)，見圖5。

與對照組比較，**P <0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖5 海藻多糖對外周血中MDA水平的影響

3 討論

EMS是育齡婦女的常見病，發(fā)病率高達(dá)10%～15%，由于EMS的發(fā)病機(jī)制不明確，治療方法需不斷完善。目前EMS的治療方法主要包括手術(shù)治療和藥物治療，但是效果不理想，無論是藥物還是保守性手術(shù)均有相當(dāng)高的復(fù)發(fā)率。海藻多糖具有多種抗炎和抗氧化作用，可以抑制炎癥反應(yīng)和氧化損傷來減輕關(guān)節(jié)炎過度損傷[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量海藻多糖對EMS均具有不同程度的改善作用，其機(jī)制主要通過抑制癥因子的分泌和過氧化物的積累發(fā)揮作用。EMS是激素依賴性疾病，體內(nèi)雌激素水平平衡失控促進(jìn)了EMS的發(fā)生和發(fā)展[17]，體內(nèi)FSH和LH的水平升高，并作用于卵巢促進(jìn)雌激素的分泌[18]。本研究表明，海藻多糖對EMS大鼠高水平的FSH和LH均有抑制作用，高劑量組使其趨于正常水平，調(diào)節(jié)激素內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂可能是其治療EMS的作用機(jī)理之一。

在EMS患者腹腔液中，腹腔巨噬細(xì)胞活化分泌大量炎癥因子，從而抑制巨噬細(xì)胞的吞噬[19]。本研究表明，海藻多糖抑制EMS大鼠血中IL-6的分泌，使其趨于正常水平，其抗炎作用可能是其治療EMS的作用機(jī)理之一。本研究檢測了外周血中MDA水平，發(fā)現(xiàn)海藻多糖可以抑制EMS大鼠血清中MDA的積累，使其趨于正常水平，其抗氧化作用可能也是其治療EMS的另一作用機(jī)制。

綜上所述，海藻多糖可以抑制卵巢部位異位內(nèi)膜的生長，降低外周血中激素水平，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失調(diào)和氧化還原失衡。提示海藻多糖確實對EMS大鼠的病情發(fā)展有確切的療效，值得進(jìn)行下一步臨床研究。