黃 浩，翁 霞

(1.北京聯(lián)創(chuàng)種業(yè)有限公司 北方事業(yè)部，北京 100020；2.鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007)

南果梨是秋子梨(PyrusussrieysissaXIX)系統(tǒng)中的優(yōu)良品種之一，為遼寧鞍山特產(chǎn).該品種果實色澤鮮艷，以果肉細(xì)膩、爽口多汁、風(fēng)味香濃而馳名于國內(nèi)外[1].南果梨隨衰老的加劇開始褐變，最后腐爛，且腐爛主要由多酚氧化酶和果膠酶的共同作用引起.果膠酶的生理生化作用是研究植物生理機(jī)制的重要線索之一，果膠質(zhì)降解將導(dǎo)致細(xì)胞分離.目前，國內(nèi)外對果膠酶的研究，主要集中在食品加工業(yè)中提高果蔬出汁率和果汁澄清方面，對果膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究較少，對南果梨果膠酶的相關(guān)研究還未見報道.因此，對南果梨果膠酶活力測定的研究，不僅為南果梨的深加工及貯藏提供理論依據(jù)，也為南果梨果膠酶的分離純化奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

南果梨：市售，購于鞍山四方臺南果梨批發(fā)市場.

3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、葡萄糖，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；檸檬酸、95%乙醇，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；牛血清蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；苯酚，天津化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；85%磷酸，天津市紅巖化學(xué)試劑廠；鹽酸，沈陽化學(xué)試劑廠.除牛血清蛋白為生物純外，其他試劑均為分析純.

PB-10 Sartorius(賽多利斯) pH計，桂寧(上海)實驗器材有限公司；FA1104電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器，江蘇金壇市恒豐儀器廠；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠酶的提取 稱取4 ℃下貯藏的南果梨10 g，放入已預(yù)冷的研缽中，按1∶3質(zhì)量體積比加入預(yù)冷(4 ℃)的pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液[2]，4 ℃下浸提2 h，濾液于4 000 r/min下離心15 min，上清液即為果膠酶粗酶液[3].

1.2.2 酶活力的測定

(1)測定原理：基于3，5-二硝基水楊酸(DNS)與醛糖共熱能產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與含有呈色氨酸化合物的反應(yīng)液顏色深淺成正比[4]，在520 nm下測其吸光度，從而可計算出果膠酶活力.

(2)主要試劑的配制:

①DNS-試劑：用400 mL蒸餾水溶解3.15 g DNS，再加入200 mL 0.5 mol/L NaOH，再依次加入91 g 酒石酸鉀鈉·4H2O、2.5 g 苯酚、2.5 g無水亞硫酸鈉，微加熱(不超過20 ℃)，不斷攪拌，直至溶液清澈透明.用蒸餾水定容至1 000 mL，保存在棕色瓶中，與二氧化碳隔絕，貯存期為6 個月.

②pH值5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液：精確稱取71.64 g磷酸氫二鈉、21.011 g檸檬酸，分別定容到1 000 mL，按10.3∶9.7混合，即可.

③糖標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取0.1 g葡萄糖，用蒸餾水定容至100 mL，獲得1 mg/mL的葡萄糖溶液.

④蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取牛血清蛋白25 mg，加水溶解并定容至100 mL，吸取上述溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL，即為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液.

⑤考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑的配制：精確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%的乙醇中，加入100 mL 85%的磷酸，最后用蒸餾水定容到1 000 mL,即為0.01%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G-250溶液.

(3)果膠酶最大吸收波長的確定:取一支試管依次加入0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、2.0 mL蒸餾水、0.5 mL果膠酶樣液，放入50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)50 min后，再加入2.5 mL DNS，沸水浴5 min后定容至10 mL，以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在400～600 nm的波長范圍內(nèi)掃描得最大吸收波長為520 nm,見圖1.

圖1 果膠酶最大吸收波長

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6支具塞刻度試管，分別向試管中加入1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0,0.2,0.4，0.6，0.8，1.0 mL，蒸餾水3.0，2.8，2.6，2.4，2.2，2.0 mL，再在每支試管中分別加入2.5 mL DNS[5]，將各管搖勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即用流水冷卻，以蒸餾水定容至10 mL，混勻，以蒸餾水為空白對照，在520 nm波長測吸光度，以葡萄糖的量為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程是y=0.577 3x+0.000 9，相關(guān)系數(shù)r=0.998 7，葡萄糖線性范圍是0～1.0 mg/mL.

(5)酶活力測定步驟:

酶活單位：1 mL酶液在50 ℃、pH值5.0的條件下，1 h分解葡萄糖產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個酶活單位(U)[6].

取兩只10 mL具塞刻度試管甲、乙，分別加入2 mL蒸餾水和0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖；甲試管中加入0.5 mL酶提取液，乙試管加入0.5 mL蒸餾水，水浴加熱50 min后,再在甲、乙兩試管中分別加入2.5 mL的3，5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min后冷卻定容至10 mL.在520 nm處按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法比色，得到相應(yīng)的吸光度值.則果膠酶酶活力計算公式為：

式中：U為酶活性，U/mg；m′為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖質(zhì)量，mg；v′為樣品提取液的總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；v為測定時所取樣品提取液體積，mL；t為酶促反應(yīng)時間，h；1.08是葡萄糖換算成半乳糖醛酸的系數(shù)(194/180).

(6)酶比活力的測定：比活力為酶活性與標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的果膠酶蛋白質(zhì)量的比值，單位為U/mg.

(7)蛋白質(zhì)最大吸收波長的確定：取1 mL果膠酶提取液，在其中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，以蒸餾水做空白對照，在400～800 nm的波長范圍內(nèi)掃描得最大吸收波長為600 nm.

(8)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支10 mL的具塞試管，分別向各試管中加入1 mg/mL牛血清蛋白溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，蒸餾水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，再在每支試管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250反應(yīng)液，將試管中溶液振蕩搖勻，放置2 min后，用TU-1810型紫外可見分光光度計、1 cm內(nèi)徑的玻璃比色皿在600 nm處測吸光度值，以蒸餾水為空白對照，吸光度為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程是y=0.002 1x+0.000 1，相關(guān)系數(shù)r=0.997 0，蛋白質(zhì)的線性范圍是0～1.0 mg/mL.

1.3 影響果膠酶活力的單因素實驗

1.3.1 底物用量對果膠酶活力的影響 向試管中分別加入0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 mg的1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、2 mL蒸餾水和0.5 mL果膠酶提取液，以蒸餾水做空白對照，在520 nm測定吸光度值，確定最適的底物用量.

1.3.2 酶濃度對酶活力的影響 向試管中分別加入0.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和2 mL蒸餾水后，再分別加入10%，30%，50%，70%，90%的果膠酶提取液，以蒸餾水做空白對照，在520 nm測定吸光度值，確定最適的果膠酶濃度.

1.3.3 pH值對果膠酶活力的影響 向試管中分別加入0.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、2 mL蒸餾水和0.5 mL30%果膠酶提取液后，用緩沖液調(diào)反應(yīng)液的pH值為4，5，6，7，8，以蒸餾水做空白對照，在520 nm測定吸光度值，確定最適的pH值.

1.3.4 溫度對果膠酶活力的影響 向試管中分別加入0.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、2 mL蒸餾水和0.5 mL30%果膠酶提取液后，以蒸餾水做空白對照，分別在30，40，50，60，70，80 ℃反應(yīng)后，在520 nm測定吸光度值，確定最適的反應(yīng)溫度.

1.3.5 反應(yīng)時間對果膠酶活力的影響 向試管中分別加入0.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、2 mL蒸餾水和0.5 mL30%果膠酶提取液，以蒸餾水做空白對照，分別反應(yīng)30，40，50，60，70 min，在520 nm測定吸光度值，確定最適的反應(yīng)時間.

1.4 影響果膠酶活力的正交實驗

為了優(yōu)化南果梨中果膠酶性質(zhì)的最佳條件，根據(jù)單因素實驗進(jìn)行五因素二水平的正交試驗，以確定最佳條件.

2 結(jié)果與分析

2.1 南果梨果膠酶活力的單因素實驗

由圖2(A)可知，隨著底物的量的增大，果膠酶的比活力先增大后減小，在底物的量為0.5 mg時，果膠酶比活力最大，所以，確定最佳底物的量為0.5 mg.

由圖2(B)可知，隨著果膠酶濃度的增大，果膠酶的比活力先增大后減小，在果膠酶濃度為40%時，果膠酶比活力最大，但是30%和40%酶濃度時，果膠酶的比活力相差不到1%，考慮到經(jīng)濟(jì)成本的問題，確定最佳酶濃度為30%.

由圖2(C)可知，隨著pH值的增大，果膠酶的比活力先增大后減小，在pH值為6時，果膠酶比活力最大，確定最佳pH值為6.

由圖2(D)可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，果膠酶的比活力先增大后減小，在反應(yīng)溫度為60 ℃時，果膠酶比活力最大，確定最佳反應(yīng)溫度為60 ℃.

圖2 (A) 底物的量對果膠酶活力的影響 圖2 (B) 酶濃度對果膠酶活力的影響

圖2 (C) pH值對果膠酶活力的影響 圖2 (D) 反應(yīng)溫度對果膠酶活力的影響

圖2 (E) 反應(yīng)時間對果膠酶活力的影響

由圖2(E)可知，隨著反應(yīng)時間的增長，果膠酶的比活力先增大后減小，在反應(yīng)時間為50 min時，酶比活力最大，確定最佳反應(yīng)時間為50 min.

2.2 南果梨果膠酶活力的正交試驗

以南果梨果膠酶比活力為測定指標(biāo)，在上述單因素試驗范圍內(nèi)設(shè)計正交試驗，試驗因素水平設(shè)計、試驗結(jié)果見表1、表2.

表1 因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果表

由表2可以看出，酶濃度極差最大，其次分別為pH值、反應(yīng)時間、底物的量、反應(yīng)溫度.各因素影響果膠酶活力的主次順序為A>B>C>D>E，因此果膠酶活力最佳測定組合為A1B2C2D2E2，即在選定酶濃度為30%、pH值為6、反應(yīng)時間為50 min、底物的量為0.5 mg、反應(yīng)溫度為60 ℃的條件下,果膠酶活力能達(dá)到最大值.

由表3可看出，A、B因素影響極顯著，C因素影響顯著，D、E因素?zé)o顯著性差異.所以酶的濃度和pH值是影響南果梨中果膠酶活力的主要因素，反應(yīng)時間次之，底物的量和反應(yīng)溫度影響不大.

表3 方差分析表

3 結(jié)論

南果梨果膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明：酶濃度為30%、pH值為6、反應(yīng)時間為50 min、底物的量為0.5 mg、反應(yīng)溫度為60 ℃的條件下，果膠酶比活力高達(dá)21 473.69 U/mg，且酶濃度、pH值影響極顯著，反應(yīng)時間影響顯著，底物的量與反應(yīng)溫度影響不顯著.