羅 裕，潘民主，莫慧慧，區(qū)瑩瑩，明火清，韋 想，黃 榮，楊日榮

1．廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530021；2．廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021；3．廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣西南寧 530021

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是多因素的過程，涉及較多基因與蛋白[1]。而微小RNA(miRNA)作為單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，其通過與靶基因的mRNA 3′-非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，降解mRNA或抑制其翻譯，調(diào)控多種細(xì)胞的功能[2-3]。miRNA失調(diào)對(duì)許多癌癥有影響，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌及前列腺癌等[4-8]。本研究通過檢測(cè)肺腺癌中miR-195的表達(dá)，研究miR-195靶基因間的相互聯(lián)系，分析靶基因的生存預(yù)后，以探討其在肺腺癌中的作用，為肺腺癌研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院11例臨床肺腺癌患者的標(biāo)本，包括癌組織與癌旁正常組織，標(biāo)本離體后在最短時(shí)間內(nèi)將癌組織及癌旁正常組織切成直徑0.5 cm的小塊，分別裝入已編號(hào)的滅菌凍存管中，迅速放入液氮轉(zhuǎn)移罐，做好長(zhǎng)期保存準(zhǔn)備。標(biāo)本存放好后，登記標(biāo)本編號(hào)、住院號(hào)、腫瘤類型、取材數(shù)量。本研究通過廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并在患者知情同意情況下進(jìn)行標(biāo)本收集。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-195在臨床標(biāo)本中的表達(dá) 取約0.1 g組織標(biāo)本放入冰預(yù)冷的含1.5 mL RNA裂解液的勻漿器中，進(jìn)行總RNA提取。反轉(zhuǎn)錄取2 μg的RNA、3 μL隨機(jī)引物，補(bǔ)DEPC水至24 μL，放入PCR儀中。70 ℃熱變性15 min，迅速冰浴3 min。按照說明書加入其他試劑，每管液體總體積約40 μL，將混合物短暫離心后置于PCR儀中，37 ℃ 90 min；向每管PCR產(chǎn)物中加入60.0 mL超純水稀釋。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA提取 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，肺腺癌A549細(xì)胞在CO2濃度為5%、飽和濕度、溫度為37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取生長(zhǎng)匯合度90%的A549細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入1.0 mL的Trizol試劑，裂解細(xì)胞。室溫靜置5 min后加入200 μL氯仿劇烈震蕩30 s，室溫靜置3 min，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)，12 000 r/min離心5 min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至離心管，加入異丙醇，于-20 ℃冰箱放置2 h以上。取出標(biāo)本，用4 ℃預(yù)冷高速離心機(jī)12 000 r/min離心30 min，去除上清液，保留的沉淀物中加入1.0 mL 70%的預(yù)冷乙醇，顛倒洗滌，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，去上清液后得到總RNA。

1.2.3目的片段的篩選及測(cè)序 利用引物設(shè)計(jì)軟件OLIGO(V7)進(jìn)行miR-195的Hybrid PCR設(shè)計(jì)。將純化后的Hybrid PCR產(chǎn)物與T載體連接，按照美國(guó)Promega公司T-Easy載體試劑盒說明書進(jìn)行操作。將連接產(chǎn)物加至感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴熱擊90 s?？焖倮鋮s2 min。加入培養(yǎng)基混勻，振蕩培養(yǎng)1 h，取菌液涂布于平板上，倒置平板37 ℃過夜培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化的藍(lán)白斑平板中挑選白色菌落進(jìn)行菌落PCR。檢測(cè)500個(gè)菌落，然后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果，挑選片段大小不一的陽(yáng)性片段相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆菌過夜搖菌培養(yǎng)，取菌液與甘油混合送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析 在獲得miR-195候選靶基因的測(cè)序序列后，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心網(wǎng)站上進(jìn)行核酸比對(duì)及基因注釋，并利用miRanda、TargetScan、RNA Hybrid等軟件分析miR-195與候選靶基因的作用，使用GeneMANIA網(wǎng)站(http://www.genemania.org/)，構(gòu)建候選靶基因作用網(wǎng)絡(luò)圖譜，最后采用生存預(yù)后網(wǎng)站(http://gepia2.cancer-pku.cn/)進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-195在肺腺癌組織中的表達(dá) 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載到肺腺癌組織標(biāo)本數(shù)據(jù)，包括癌組織519例及癌旁正常組織46例。在癌組織中miR-195的相對(duì)表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1A。收集11例臨床肺腺癌患者的癌組織與癌旁正常組織標(biāo)本，分別檢測(cè)miR-195的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-195在癌組織的相對(duì)表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1B。

2.2miR-195靶基因的篩選 根據(jù)Hybrid PCR結(jié)合序列匹配的基本原則，設(shè)計(jì)miR-195互補(bǔ)引物，進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示miR-195的Hybrid PCR產(chǎn)物有多條DNA條帶，見圖2A。通過藍(lán)白斑篩選出約500個(gè)白色菌落進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示不同大小的條帶，見圖2B。挑選96個(gè)不同大小片段的T載體進(jìn)行測(cè)序，得到19個(gè)不同序列。對(duì)測(cè)序得到的不同長(zhǎng)度DNA 序列進(jìn)行核酸序列比對(duì)，并進(jìn)行基因注釋，結(jié)果見表1。

注：A表示TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肺腺癌標(biāo)本miR-195的相對(duì)表達(dá)水平；B表示臨床肺腺癌標(biāo)本miR-195的相對(duì)表達(dá)水平。

注：A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Hybrid PCR產(chǎn)物；B表示菌落PCR產(chǎn)物。

2.3肺腺癌miR-195靶基因結(jié)合位點(diǎn)分析及作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用生物信息學(xué)軟件對(duì)肺腺癌miR-195靶基因的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析顯示，miR-195結(jié)合位點(diǎn)在靶基因 3′UTR 上有19個(gè)，見表1。根據(jù)miRNA種子序列完全匹配原則，與 miR-195種子序列完全匹配的有19個(gè)靶基因，分別為ATP6V1B2、M6PR、GCLC0、TNIP2、NOB1、SUMO3、FOPNL、IPO7、GDI2、CREG1、RRAGA、MAFK、CEACAM6、SELENBP1、THRAP3、CYBRD、ANKIB1、PPT1、FDFT1，見圖3。再利用GeneMANIA網(wǎng)站(http://www.genemania.org/)分析上述靶基因，得到作用網(wǎng)絡(luò)及靶基因間的關(guān)系，結(jié)果顯示，靶基因SUMO3與IPO7之間有直接的相互作用，見圖4。

2.4靶基因生存預(yù)后分析 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)miR-195的靶基因進(jìn)行生存預(yù)后分析，Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示，與高表達(dá)患者相比，低表達(dá)GCLC、NOB1的患者預(yù)后較好(P<0.05)，見圖5。

圖3 肺腺癌 miR-195靶基因結(jié)合位點(diǎn)分析

圖4 候選靶基因作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

表1 肺腺癌 miR-195靶基因序列比對(duì)及基因注釋

注：A、B分別為GCLC、NOB1生存曲線。

3 討 論

肺腺癌是對(duì)人類的健康與生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率正在逐年上升[1]。越來越多的研究結(jié)果顯示，肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多種環(huán)境因素影響、細(xì)胞自身多種基因失活或基因過度激活共同作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌常見的基因變異有表皮生長(zhǎng)因子受體、Kirsten鼠肉瘤病毒基因等，不同的基因變異型患者存在不同的治療靶點(diǎn)[9]。miR-195作為影響癌癥的重要因子可以通過下調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，抑制SNU-1和KATO-3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，控制癌癥的發(fā)展[10]。miR-195也可以通過調(diào)節(jié)SALL4來抑制膠質(zhì)瘤的增殖和遷移[11]。研究顯示，miR-497～miR-195團(tuán)簇通過維持內(nèi)皮細(xì)胞Notch和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)活性來調(diào)節(jié)成骨過程中的血管生成[12]。同時(shí)，miR-195可以直接靶向CX3CL1/CX3CR1預(yù)防局灶性腦缺血[13]。本研究首先在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到肺腺癌的測(cè)序數(shù)據(jù)，比對(duì)癌旁正常組織與癌組織中miR-195的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-195在癌組織中相對(duì)表達(dá)水平低于癌旁正常組織。通過檢測(cè)11例臨床肺腺癌標(biāo)本中miR-195的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁正常組織，癌組織中的miR-195表達(dá)下調(diào)，推測(cè)miR-195的相對(duì)表達(dá)水平與肺腺癌的發(fā)生具有相關(guān)性。為進(jìn)一步了解miR-195調(diào)控肺腺癌的相關(guān)因素，筆者利用Hybrid PCR模擬miR-195與靶基因的結(jié)合，并利用菌落PCR篩選Hybrid PCR產(chǎn)物條帶，發(fā)現(xiàn)miR-195對(duì)應(yīng)多個(gè)靶基因。隨后，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)方法篩選出miR-195在肺腺癌中的19個(gè)靶基因等。據(jù)報(bào)道，SUMO化修飾能夠調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)控細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持基因組完整性[14]。本研究構(gòu)建靶基因作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SUMO3可以調(diào)控IPO7。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-22可下調(diào)IPO7從而影響低氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)[15]。最后對(duì)靶基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者靶基因GCLC、NOB1低表達(dá)與肺腺癌良好預(yù)后相關(guān)。有報(bào)道稱，GCLC和GCLM在外周T細(xì)胞淋巴瘤組織中高表達(dá)，可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，且NOB1蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率會(huì)降低[16-17]。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了肺腺癌中miR-195的功能及靶基因之間的相互關(guān)系，為肺腺癌的研究提供了有效依據(jù)。隨著研究的深入，肺腺癌miR-195及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將逐步清晰，miR-195有可能成為肺腺癌的一個(gè)新的標(biāo)志物，但仍需要繼續(xù)探索miR-195在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制，為肺腺癌的診斷、藥物治療、預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新的靶點(diǎn)。