李陽波，李 健，賈志剛，許亞宏，劉 瓊，莫 非，李弋戈

西部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610021

前列腺癌是男性最為常見的惡性腫瘤之一，也是全球男性癌癥患者的主要死因。隨著人口老齡化程度加深，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而前列腺癌的發(fā)病機制至今未明[1]。微小RNA(miRNA)是哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)性保守的非編碼RNA(ncRNA)，其大小為18～25 nt，可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控模式調(diào)控靶基因的表達(dá)[2]。ncRNA可通過多種途徑影響轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子和腫瘤壞死因子的表達(dá)，參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。有研究指出，miR-200家族(miR-200a/b、miR-141和miR-429)可通過靶向調(diào)控Zeb2抑制前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，上調(diào)下游靶基因的表達(dá)從而抑制前列腺癌的進(jìn)程[5]。此外，miR-410-3p可作用于磷酸酶及張力蛋白同源基因，調(diào)控AKT/mTOR信號通路，在前列腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[6]；miR-141-3p可通過激活核因子-κB信號通路促進(jìn)前列腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[7]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中miR-152的相對表達(dá)水平顯著低于正常癌旁組織，隨著腫瘤惡性程度的升高，前列腺癌組織中miR-152的相對表達(dá)水平越低[8]。生物信息學(xué)法預(yù)測叉頭框蛋白R2(FOXR2)可能為miR-152的直接靶基因。因此，本文研究miR-152和FOXR2之間的調(diào)控作用，并探討二者對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響，為前列腺癌的發(fā)生機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株來源 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3(前列腺癌細(xì)胞組)和前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1(對照組)購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(ATCC)。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng) PC-3和RWPE-1細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃ 5% CO2，待細(xì)胞生長至70%～80%時，0.25%胰酶消化后以1∶3傳代。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。Trizol試劑、lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑、BCA蛋白檢測試劑盒、蛋白上樣緩沖液購自中國碧云天公司。FOXR2抗體和GAPDH內(nèi)參抗體購自英國Abcam公司，引物由上海恒斐公司合成，TaqMan?Universal PCR Master Mix、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國ABI公司，miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和FOXR2-siRNA由上海吉瑪公司合成。雙熒光素酶檢測試劑盒、pmir-GLO載體購自美國Promega公司。

1.2.2Western blot檢測FOXR2蛋白水平 RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測后，加入蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠70 V轉(zhuǎn)120 V電泳分離蛋白，250 mA轉(zhuǎn)膜1.0 h，室溫封閉1.5 h，F(xiàn)OXR2一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育2.0 h，超敏發(fā)光液顯色，膠片曝光后，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image軟件計算FOXR2蛋白水平，實驗重復(fù)5次。

1.2.3實時熒光定量PCR(qPCR)檢測miR-152和FOXR2 mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后，將其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后使用美國Bio-rad公司的 CFX96 qPCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，SYBR Green染料標(biāo)記產(chǎn)物，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)熒光強度計算目的基因的相對表達(dá)水平，實驗重復(fù)5次。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 6孔板中接種106個PC-3細(xì)胞，無血清饑餓培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染物(miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、FOXR2-siRNA)和lipofectamine 2000分別加入到等體積無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，然后將二者混勻后，繼續(xù)室溫孵育20 min，將混合液加入到已傾去培養(yǎng)基的6孔板中，培養(yǎng)箱中孵育6 h，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再進(jìn)行檢測。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后接種于96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，每孔加入20 μL的 MTT溶液，4 h后棄去上清液，每孔加入200 μL的二甲基亞砜，37 ℃搖晃10 min后，490 nm處測定吸光度值(A490)，評價細(xì)胞活性，用以反映細(xì)胞增殖能力。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測 miRanda、NBmiRTar等數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-152與FOXR2 3′ UTR可能的基因結(jié)合序列。將克隆的FOXR2 3′UTR區(qū)及其突變體分別插入到pmir-GLO載體，以此構(gòu)建FOXR2 3′UTR野生型和突變型質(zhì)粒。將miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和miR-152 scramble分別與融合FOXR2 3′UTR區(qū)及其突變體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，培養(yǎng)箱中孵育48 h，棄去液體后加入裂解液，室溫放置10 min，-80 ℃凍融1次，離心收集上清液，加入熒光素底物，充分混勻10 s后，檢測熒光強度，再加入海參熒光素酶底物，混勻10 s后再次檢測熒光素酶活性，計算相對熒光強度，實驗重復(fù)5次。

2 結(jié) 果

2.1RWPE-1和PC-3細(xì)胞中miR-152、FOXR2 mRNA的相對表達(dá)水平及FOXR2蛋白水平 PC-3細(xì)胞中miR-152的相對表達(dá)水平為RWPE-1細(xì)胞的40.91%(P=0.001)；而PC-3細(xì)胞中FOXR2 蛋白水平及mRNA的相對表達(dá)水平分別為RWPE-1細(xì)胞中FOXR2 蛋白及mRNA的205.75%和167.61%(P=0.003、0.003)。見表1、圖1。

表1 RWPE-1和PC-3細(xì)胞中miR-152和FOXR2 mRNA的相對表達(dá)水平及FOXR2蛋白水平

圖1 RWPE-1和PC-3細(xì)胞中FOXR2蛋白表達(dá)的Western blot圖

2.2miR-152和FOXR2對PC-3細(xì)胞增殖能力的影響 miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和FOXR2-siRNA分別轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，通過MTT法評價細(xì)胞增殖活性，以各組A490值為計算依據(jù)，對照組A490值為0.91±0.18，miR-152 mimics、miR-152 inhibitor和FOXR2-siRNA組A490值的分別為0.66±0.88、1.18±0.14和0.59±0.06，該3組的細(xì)胞增殖效率與對照組相比，分別降低27.47%、升高29.67%和降低35.16%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022、0.029、0.006)。

2.3miR-152對PC-3細(xì)胞FOXR2 3′UTR區(qū)的影響 分別共轉(zhuǎn)染miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、miR-152 scramble和FOXR2 3′UTR突變型質(zhì)粒后，熒光素酶活性均無顯著變化(P=0.542)。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、miR-152 scramble分別與FOXR2 3′UTR野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，熒光素酶活性分別顯著降低、升高、無顯著變化(P=0.001、0.001、0.428)。

2.4轉(zhuǎn)染miR-152對PC-3細(xì)胞中FOXR2 mRNA相對表達(dá)水平及蛋白水平的影響 與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-152 mimics后，miR-152 mRNA的相對表達(dá)水平升高10倍以上(P<0.001)，而FOXR2 mRNA的相對表達(dá)水平及蛋白水平分別降低42.40%和29.73%(P<0.001、0.001)，細(xì)胞活性降低28.74%(P=0.013)。轉(zhuǎn)染miR-152 inhibitor后，miR-152的相對表達(dá)水平下降18.64%(P<0.001)，而FOXR2 mRNA的相對表達(dá)水平及蛋白水平上升61.60%和54.05%(P<0.001、P=0.007)，細(xì)胞活性增加37.93%(P=0.018)。見表2、圖2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-152對PC-3細(xì)胞中FOXR2 mRNA相對表達(dá)水平及蛋白水平的影響

注：A表示轉(zhuǎn)染miR-152 mimics對FOXR2蛋白的影響；B表示轉(zhuǎn)染miR-152 inhibitor對FOXR2蛋白的影響。

3 討 論

前列腺癌是一種男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，全球發(fā)病率較高，且缺乏公認(rèn)的治療方法[9]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，以miRNA為靶標(biāo)治療腫瘤成為研究熱點，miRNA通過結(jié)合靶基因3′UTR區(qū)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān)[10]。目前，已有多種miRNA被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌患者血清或癌組織中異常表達(dá)，并且miRNA的相對表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床分級、化療敏感性和骨轉(zhuǎn)移等顯著相關(guān)[11]。如miR-618可通過負(fù)調(diào)控FOXP2抑制前列腺癌的遷移和侵襲能力[12]；miR-199a-3p可通過靶向調(diào)控Smad1抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[13]。miR-152在其他腫瘤細(xì)胞中的作用已有報道，如miR-152-3p在非小細(xì)胞肺癌中抑制腫瘤細(xì)胞增殖，在子宮內(nèi)膜癌中抑制腫瘤細(xì)胞形成、轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。研究表明，前列腺癌細(xì)胞中miR-152啟動子序列呈高度甲基化，而miR-152異位表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，且miR-152的相對表達(dá)水平降低可導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移增加等不良臨床結(jié)果[15]。

生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)OXR2可能為miR-152的直接靶基因。FOX屬于保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、生長等關(guān)鍵生物學(xué)過程，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16]。FOXR2是最新發(fā)現(xiàn)的一個致癌基因，可促進(jìn)膠質(zhì)瘤[17]、結(jié)直腸癌[18]、肝細(xì)胞癌[19]等多種腫瘤細(xì)胞增殖，成為治療腫瘤的最新研究靶點。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXR2在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，降低FOXR2 mRNA的相對表達(dá)水平可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，有望成為治療前列腺癌的新靶標(biāo)[20]。

本研究結(jié)果表明，在PC-3細(xì)胞系中，miR-152的相對表達(dá)水平顯著低于RWPE-1細(xì)胞系，而FOXR2 mRNA的相對表達(dá)水平及蛋白水平顯著升高，表明miR-152和FOXR2對于前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，miR-152 mimics和FOXR2-siRNA分別轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，細(xì)胞增殖均顯著降低，而miR-152 inhibitor轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞可使細(xì)胞增殖能力升高，該結(jié)果說明miR-152和FOXR2能夠調(diào)控PC-3細(xì)胞增殖能力，甚至二者之間可能存在某些調(diào)控關(guān)系。生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)OXR2可能為miR-152的直接靶基因，而本研究雙熒光素報告基因?qū)嶒炞C實，miR-152可從基因水平直接負(fù)調(diào)控FOXR2基因表達(dá)。轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-152 mimics后可下調(diào)FOXR2 mRNA的表達(dá)，繼而抑制FOXR2蛋白翻譯，降低FOXR2蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染miR-152 inhibitor可上調(diào)FOXR2 mRNA表達(dá)，最終增強FOXR2蛋白翻譯能力，表明miR-152可通過直接負(fù)調(diào)控FOXR2基因轉(zhuǎn)錄，繼而影響FOXR2蛋白翻譯水平。以上結(jié)果提示可嘗試通過增強前列腺癌細(xì)胞中miR-152基因表達(dá)，抑制FOXR2基因和蛋白表達(dá)，繼而抑制細(xì)胞增殖，達(dá)到緩解前列腺癌的治療目標(biāo)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-152表達(dá)能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖能力，該作用可能與其負(fù)調(diào)控FOXR2表達(dá)有關(guān)。