楊金香，朱妍妍，李鴻曄，于利利，陳文，韓博

(石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

2019年全球約有4.63億20～79歲成年人患糖尿病，同年約有420萬人死于糖尿病，約占全球全死亡因素的11.3%[1]，其中T2DM患者占糖尿病患者的 90%左右[2]。此外，T2DM 引發(fā)的急慢性并發(fā)癥也給國家、社會及患者家屬帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。T2DM的發(fā)病率隨著年齡、肥胖、壓力、缺乏鍛煉等各種因素增加而增加。口服降糖藥物主要以降血糖為主，但長期服用會產(chǎn)生各種副作用，如磺脲類降糖藥會出現(xiàn)體重增加、低血糖和胃腸道不良反應(yīng)，非磺脲類促泌劑會導(dǎo)致低血糖和體重增加，長期服用雙胍類藥物、α-糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖)會產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng)等副作用，限制了這些藥物的臨床應(yīng)用[3]。

中草藥在T2DM治療中起著重要作用。與合成藥物相比，中草藥治療T2DM的優(yōu)勢在于其多組分和多靶點可產(chǎn)生聯(lián)合或協(xié)同作用[4]。2020年3月上市的桑枝總生物堿片為桑枝中提取得到的總生物堿，可有效降低T2DM受試者糖化血紅蛋白水平，為T2DM患者提供了一種新的治療選擇，也增強了研究人員從中草藥中尋找抗T2DM先導(dǎo)化合物的信心。

沙生蠟菊(Helichrysumarenarium(L.)Moench)主要分布在歐洲以及中亞等地，在中國新疆的北部也有分布。沙生蠟菊為新疆民間特色藥材，俄羅斯及塞爾維亞傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)等也已將沙生蠟菊用于治療疾病[5]。據(jù)以往的研究報道稱沙生蠟菊提取物具有降血糖作用[6]，MORIKAWA 發(fā)現(xiàn)沙生蠟菊甲醇提取物可以抑制血糖升高，其提取物還可抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)活性[7]。

另外，蠟菊屬植物也具有降血糖活性[8]。盡管研究已證實沙生蠟菊具有潛在的抗糖尿病的作用，但目前對沙生蠟菊中潛在生物活性成分、靶點、相關(guān)通路和藥理作用機制仍缺乏系統(tǒng)的分析和解釋。因此，本工作通過系統(tǒng)藥理學(xué)的策略來闡明沙生蠟菊中的潛在活性化合物，確定治療靶點并解釋治療疾病的機制。

系統(tǒng)藥理學(xué)側(cè)重疾病-藥物的多成分、多靶點分析，為了解疾病的發(fā)病機理及相關(guān)藥物的作用機制提供了多維度視角，是一種尋找生物活性成分和分子靶點及其相互作用的非常有吸引力的工具。Li等人對葛根芩連湯配方進行了系統(tǒng)藥理學(xué)分析確定了潛在降糖成分，并闡明了其機理[9]。根據(jù)系統(tǒng)藥理學(xué)原理，HE等人[10]預(yù)測了六味地黃丸中的活性成分及潛在靶點，并闡明其治療T2DM的作用機制。GUO等人[11]借助系統(tǒng)藥理學(xué)研究了藥對黃芪和山藥治療T2DM的機制。通常，系統(tǒng)藥理學(xué)的化合物數(shù)據(jù)庫是基于TCMSP庫及文獻查找等數(shù)據(jù)挖掘而建立的，這會導(dǎo)致所建立的化合物數(shù)據(jù)庫與中草藥中實際存在的化合物之間存在偏差，致使靶點和作用機制信息不準確[12]。因此，本工作將UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)與系統(tǒng)藥理學(xué)相結(jié)合，在系統(tǒng)表征沙生蠟菊中化學(xué)成分的基礎(chǔ)上應(yīng)用系統(tǒng)藥理學(xué)去探討和分析沙生蠟菊中潛在的降血糖活性成分與T2DM 之間的關(guān)系。

本工作通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對沙生蠟菊中成功表征的化學(xué)成分構(gòu)建了沙生蠟菊化合物數(shù)據(jù)庫。通過OB、DL的分子水平評價，得到了沙生蠟菊的潛在活性成分，并且預(yù)測其潛在靶點。并通過Cytoscape3.6.1軟件繪制沙生蠟菊中化合物、靶點、組織和疾病之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析。最后結(jié)合GO功能富集分析，從系統(tǒng)水平預(yù)測沙生蠟菊抗T2DM的分子作用機制，本工作的思路如圖1所示。

1 資料與方法

1.1 沙生蠟菊化合物數(shù)據(jù)庫的建立

為了梳理沙生蠟菊中的化學(xué)成分，本小組在檢索SciFinder、PubMed、ScienceDirect和CNKI等數(shù)據(jù)庫中55篇文獻已報道的化合物的基礎(chǔ)上，對化合物名稱、分子量、分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了總結(jié)。建立了蠟菊屬植物的化合物庫，采用UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)對沙生蠟菊進行了快速定性分析，構(gòu)建了含有55個化合物的沙生蠟菊化合物數(shù)據(jù)庫。借助Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、CHEMBL(http://www.ebi.ac.uk/chembl/)和Chemspider(http://www.chemspider.com/)下載通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)成功表征的55個化合物結(jié)構(gòu)，并繪制其結(jié)構(gòu)，根據(jù)糖苷酶水解反應(yīng)去除糖基，去糖基前后均將化合物另存為mol 2格式的3D模式。

1.2 活性成分的篩選

OB值是決定生物活性分子類藥性的關(guān)鍵指標，DL值綜合反映了藥物的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。本工作采用西北大學(xué)王永華教授團隊構(gòu)建的計算機模型OBioavail 1.1預(yù)測OB值，采用Tanimoto系數(shù)預(yù)測DL值。選擇以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選活性化合物的標準。

1.3 候選化合物作用靶點的預(yù)測

系統(tǒng)藥理學(xué)中隨機森林(RF)和支持向量機(SVM)是兩個數(shù)學(xué)建模工具被應(yīng)用于系統(tǒng)藥物打靶，從而來判斷化合物-靶點間的相關(guān)性大小。為分析沙生蠟菊抗T2DM的作用機理，使用RF算法和SVM算法的模型對候選化合物進行靶點預(yù)測，通過RF≥0.8與SVM≥0.7的標準，預(yù)測潛在活性化合物的蛋白靶點。

1.4 相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本工作構(gòu)建了4個相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，包括1)化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)(C-T網(wǎng)絡(luò))。將沙生蠟菊候選化合物和預(yù)測靶點映射到網(wǎng)絡(luò)中，構(gòu)建C-T網(wǎng)絡(luò)圖。(2)靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(T-P網(wǎng)絡(luò))。將預(yù)測靶點映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建了T-P網(wǎng)絡(luò)圖，從而連接蛋白靶點及其相關(guān)的生物學(xué)途徑。(3)靶點-組織定位網(wǎng)絡(luò)。獲得每個靶基因在人體84個器官組織中的mRNA表達水平，并計算各靶基因mRNA在器官中平均表達水平；篩選出mRNA表達水平高于平均水平的器官或組織，作為該靶基因所定位器官或組織；以胰腺、肝、骨骼肌、腎、心和腦為主要定位器官，通過連接靶標和相關(guān)組織，預(yù)測化合物主要作用組織和器官。(4)靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(T-D網(wǎng)絡(luò))。通過連接預(yù)測靶標和相關(guān)性較大的疾病類型，為沙生蠟菊重新定位(預(yù)測治療其他疾病的可能性)提供可能。通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，旨在全面闡明化合物、靶點、疾病及相關(guān)通路之間的復(fù)雜關(guān)系。

在可視化網(wǎng)絡(luò)中，每個生物成分被標記為節(jié)點(node)，這些節(jié)點之間的相互作用用邊(edge)表示。其中節(jié)點代表分子(靶點、通路、組織、化合物和疾病等)，邊則表示各節(jié)點之間的交互關(guān)系。所有的網(wǎng)絡(luò)圖均由Cytoscape3.6.1軟件繪制，用于集成、分析和可視化生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，提供了有關(guān)沙生蠟菊和T2DM之間復(fù)雜相互作用的信息。

1.5 GO分析及通路富集分析

本工作將靶點與DAVID數(shù)據(jù)庫連接起來，進行了GO分析。GO 可分為生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)3個部分。根據(jù)基因的GO注釋以及KEGG通路注釋分析，以人類基因為背景，利用DAVID 基因功能分類工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對沙生蠟菊中收集的與 T2DM相關(guān)的靶基因進行 GO和通路富集分析。利用GO和通路富集分析了解差異基因富集在哪些生物過程和通路上，計算每條富集通路的P值，以P<0.05判斷相關(guān)，被認定為顯著富集。將生物過程及KEGG富集通路顯著富集到具體條目上，對P值排序后取前 20 名進行分析。

2 結(jié)果

2.1 沙生蠟菊化合物數(shù)據(jù)庫的建立及活性成分的篩選

參考了55篇文獻建立的蠟菊屬植物的化合物文庫，共收集了332個化合物，其中包括137個黃酮、51個酚酸、51個糖苷、18個α-吡喃酮、5個香豆素、6個萜類、7個甾醇、8個木脂素以及49個其他類化合物。在此基礎(chǔ)上借助UPLC-Q-TOF-MS對沙生蠟菊中化學(xué)成分進行表征，得到正、負離子模式下的基峰強度色譜(base peak intensity chromatograms，BPI)圖(圖2)。UPLC-Q-TOF-MS表征的沙生蠟菊中化學(xué)成分比較化合物的精確分子量、色譜tR和電噴霧多級質(zhì)譜(MS)裂解數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻報道的各類化合物MS裂解規(guī)律和化合物結(jié)構(gòu)，分析得出了沙生蠟菊中的55個化合物分為6類，包括29個黃酮、7個酚酸、4個木質(zhì)素、4個萜類、3個甾體以及8個其他類化合物。

圖2 沙生蠟菊提取液在正、負離子模式下的BPI圖

利用ADME過程對沙生蠟菊化合物庫中潛在的活性成分進行篩選，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，篩選出的沙生蠟菊化合物庫中化學(xué)成分對應(yīng)的ADME參數(shù)見表S2，發(fā)現(xiàn)了14個具有良好藥代動力學(xué)特性的化合物，其中包括9個黃酮類化合物、1個酚酸類化合物、2個甾醇類化合物和2個其他類化合物。潛在活性成分及其相應(yīng)的ADME參數(shù)見表1。

表1 潛在活性化合物及其相應(yīng)的ADME參數(shù)

2.2 靶點預(yù)測

通過RF≥0.8與SVM≥0.7的標準，預(yù)測沙生蠟菊潛在活性化合物的蛋白靶點有34個，分子與靶點的對應(yīng)關(guān)系如表2所示。

表2 以Degree值由高到低排列的潛在活性化合物與靶點的對應(yīng)關(guān)系

2.3 C-T網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將表2中沙生蠟菊候選化合物和預(yù)測靶點映射到網(wǎng)絡(luò)上，建立得到C-T網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，包括48個節(jié)點(14個候選化合物和34個靶點)和177個配體-靶點相互作用。由表2和C-T網(wǎng)絡(luò)圖可看出，一個候選化合物可能作用于多個靶點，而一個靶點也可能與多個候選化合物相互作用。候選化合物的degree值從1到23不等，其平均值約為13，其中Subscandenin對應(yīng)的靶點數(shù)最多(degree=23)，即degree值最高；3,5-二羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、高圣草素和望春花酮A的degree值次之(degree=22)；而異綠原酸A、Tortoside B和蒙花苷的degree值均為1。

圖3 沙生蠟菊C-T網(wǎng)絡(luò)圖

本工作得到沙生蠟菊C-T網(wǎng)路顯示重要的潛在活性化合物為Subscandenin、山奈酚、柚皮素、芹菜素、野黃芩素、3,5-二羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、高圣草素和望春花酮A，這些化合物具有很高的連接度，作用于多個糖尿病靶點，提示這些成分可能參與了沙生蠟菊的降糖過程(表2、圖3)。

結(jié)合文獻資料及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)結(jié)果分析，部分潛在活性化合物已被報道與治療糖尿病有關(guān)。如山奈酚可通過抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠的kappa B蛋白激酶/核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(IKK/NF-κB)信號通路，下調(diào)IKK，抑制NF-κB通路。炎癥是IR和T2DM代謝紊亂的基礎(chǔ)，因而減少肝臟炎性病變可增強胰島素敏感性；也可顯著降低血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血清游離脂肪酸的循環(huán)水平，脂質(zhì)代謝增加可能影響肝相關(guān)的過氧化物酶體增殖物活化受體α(PPARα)基因，減輕IR[13]；山奈酚能顯著改善胰島素刺激下的成熟3T3-L1脂肪細胞攝取葡萄糖的能力，通過降低血糖、改善胰島素敏感度來維持正常血脂水平[14]。柚皮素可激活PI3K-Akt信號通路，調(diào)節(jié)MAPK通路，減輕IR[15]；刺激GLUT4，介導(dǎo)骨骼肌葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運，胰島素誘導(dǎo)谷氨酸從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜，從而增加周圍組織對葡萄糖的吸收[16]；柚皮素也可降低氧化應(yīng)激和炎癥，降低血糖和血脂，改善糖耐量受損。芹菜素作為治療多種炎癥疾病的藥物，通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK 1/2)活化抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)的NF-κB的激活。通過調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)多種細胞信號通路，抑制促炎細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，通過氧化應(yīng)激相關(guān)信號通路改善高血糖和抗氧化；同時改善血管內(nèi)皮功能障礙、抑制胰島素介導(dǎo)的一氧化氮生成、抑制NF-κB介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)[11]。此外，預(yù)測化合物Subscandenin、野黃芩素、3,5-二羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、高圣草素和望春花酮A與治療T2DM有相關(guān)作用，其degree值均大于或等于19，因此這些潛在活性成分也不能忽視。

由表2和圖3所示的C-T網(wǎng)絡(luò)圖可知，沙生蠟菊中的潛在靶點的degree值從1到11不等，其degree平均值約為5。其中，雌激素受體(ESR1)對應(yīng)最多的靶點(degree=11)，其次是雄激素受體(AR，degree=10)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ，degree=9)，雖然有6個靶點的degree為1，但卻是某個成分的特有靶點。例如ADRA1B僅與化合物Subscandenin具有連接度，NOS3和PDE3A僅與化合物望春花酮A連接，PGR與NR3C2僅和化合物烏沙苷元連接，說明這些靶點是化合物作用的特殊靶點，值得關(guān)注深入研究。沙生蠟菊中靶點的生化類型分析如圖4所示，靶點分布如下：酶(52.94%)、核受體(20.59%)、轉(zhuǎn)錄因子(8.82%)、離子通道(5.88%)等(圖4 A)。沙生蠟菊中的藥物靶點富含酶，突出了酶靶點在沙生蠟菊治療T2DM中的關(guān)鍵作用，在如圖4B所示的酶靶點分析中，轉(zhuǎn)移酶占比最大(38.89%)，其余依次為水解酶(27.78%)、氧化還原酶(22.22%)、裂合酶(11.11%)。

圖4 沙生蠟菊中靶點的生化類型分析

沙生蠟菊中的部分靶點已被證明與治療糖尿病有關(guān)，如ESR1、AR、PPARγ、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2(PTGS2)和碳酸酐酶2(CA2)。ESR1與胰腺β細胞的功能密切相關(guān)，被認為是治療女性T2DM患者的潛在靶點。雌激素可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑，促進錯誤折疊的胰島素原降解，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保護小鼠和人胰腺β細胞，從而促進胰島素分泌；ESR1的表達升高，激活A(yù)kt-Nrf2信號，抑制TGF β通路，使氧化應(yīng)激和凋亡被抑制，以達到治療糖尿病心肌病[18]。AR通過抑制NF-κB介導(dǎo)的PTP1B表達，調(diào)節(jié)下丘腦胰島素信號和胰島素敏感性，減輕肝臟IR和脂肪堆積；通過AR依賴機制保護鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的雄性大鼠胰腺早期凋亡損傷，對胰島β細胞有保護作用[19]。PPARγ的配體已成為治療T2DM的有效胰島素增敏劑，非脂肪組織中的游離脂肪酸和脂質(zhì)積累水平的增加與IR的發(fā)生有關(guān)，PPARγ促進脂肪庫中的脂肪酸儲存，并調(diào)節(jié)影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)的相關(guān)脂肪細胞分泌激素。PPARγ可提高胰島素敏感性，促進胰島素分泌。PTGS作為誘導(dǎo)型酶，能催化主要的炎性介質(zhì)-前列腺素的生成，研究證明PTGS2與治療糖尿病有關(guān)[20]。CA2被Subscandenin、山奈酚、柚皮素、芹菜素、野黃芩素、3,5-二羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、高圣草素和望春花酮A靶向，表明沙生蠟菊可通過調(diào)節(jié)CA2治療T2DM。而CA2與糖尿病治療有關(guān)已有實驗證實[21]。

2.4 T-P網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了解沙生蠟菊治療T2DM的機制，本工作提取了14條KEGG數(shù)據(jù)庫(www.genome.jp/kegg)中與糖尿病最相關(guān)的通路，將預(yù)測的靶點映射到提取的相關(guān)通路上，構(gòu)建了如圖5所示的T-P網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)由35個節(jié)點(包括21個靶點和14條通路)和49條邊組成。

圖5 沙生蠟菊中與糖尿病相關(guān)的T-P網(wǎng)絡(luò)圖

由圖5可知，相關(guān)通路的degree值從1到7不等。根據(jù)T-P相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得出沙生蠟菊預(yù)測靶點主要與雌激素信號通路(degree=7)、PI3K-Akt信號通路(degree=7)胰島素信號通路(degree=5)、鈣信號通路(degree=5)等信號通路相關(guān)。沙生蠟菊中與糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)信號通路分布的分析結(jié)果如圖6所示，這4個主要糖尿病相關(guān)靶點占比為28.57%，還有71.43%的通路是與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的。

圖6 沙生蠟菊中與糖尿病相關(guān)信號通路分布

在與糖尿病相關(guān)信號通路中，PI3K-Akt信號通路是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，胰島素是葡萄糖穩(wěn)態(tài)不可缺少的調(diào)節(jié)因子，胰島素主要通過PI3K-Akt信號通路來調(diào)控血糖，是調(diào)控血糖的主要信號通道，PI3K-Akt信號通路障礙或下游靶蛋白功能受損，均會引起糖代謝紊亂，引起IR[22]。雌激素是雌激素信號通路調(diào)控因子，能與細胞膜上ESR結(jié)合或者與G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，從而激活PI3K-Akt信號通路[23]。胰島素信號通路也與IR和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)[24]。胞質(zhì)游離鈣離子濃度的變化在控制胰腺β細胞分泌胰島素過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，鈣離子信號通路控制胰島素分泌，也與T2DM相關(guān)[25]。同時其他通路如AMPK信號通路、環(huán)磷酸腺苷信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等也與糖尿病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

2.5 靶點-組織定位圖構(gòu)建與分析

基于BioGPS庫(accessible at http://biogps.org/)中不同組織類型的微陣列分析數(shù)據(jù)確定靶標的組織分布。mRNA表達的微陣列分析顯示，34個靶標在84個正常組織中均具有其表達譜。根據(jù)BioGPS數(shù)據(jù)庫，34個靶標在不同水平的人體組織中普遍存在。因糖尿病對應(yīng)的主要器官是胰腺、肝、骨骼肌、腎、心和腦，所以本工作主要分析了以上器官，認為高于84個正常組織的平均degree值為高度存在組織。

由圖7所示的沙生蠟菊靶點-組織定位圖所示，該網(wǎng)絡(luò)由41個節(jié)點(包括34個靶點和7條通路)和63條邊組成，沙生蠟菊中的34個靶標主要分布于心臟、肝臟和骨骼肌，另外也有靶標分布于胰腺、大腦、腎臟等其他組織，可見沙生蠟菊是通過多個組織中的不同靶點發(fā)揮治療T2DM作用。已有文獻報道肝臟、肌肉、胰腺、大腦等組織存在治療T2DM的潛在靶點[26]，但心臟中含有治療T2DM的潛在靶點無相關(guān)實驗研究支持，這些靶點為沙生蠟菊抗T2DM的藥理機制的研究提供了新的思路。如SCN5A編碼的Nav1.5能特異性作用于心臟組織中的鈉離子通道，并在特化的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)和心肌細胞中高表達，沙生蠟菊通過干預(yù)SCN5A達到治療糖尿病心肌病的作用[27]，因此對所預(yù)測的心臟中其他靶點仍需做進一步的實驗驗證。

圖7 沙生蠟菊靶點-組織定位圖

2.6 T-D網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析

基于化合物可能作用于不同的疾病，為研究沙生蠟菊治療其他疾病的可能性以及直觀地看出靶點與疾病之間的關(guān)系，構(gòu)建了T-D網(wǎng)絡(luò)圖。由圖8所示的網(wǎng)絡(luò)圖可見，包含 150個節(jié)點(28個靶點和 132種疾病)，其中132 種疾病中主要包括細菌和真菌感染(5種)、心腦血管疾病(38 種)、消化系統(tǒng)疾病(5種)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(5種)、免疫系統(tǒng)疾病(2種)、精神障礙(7種)、腫瘤(39種)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(9種)、營養(yǎng)代謝性疾病(6種)、病理體征和癥狀(7種)、呼吸道疾病(6種)和皮膚、結(jié)締組織疾病(3種)等。

沙生蠟菊的活性靶點與T2DM有相關(guān)性，同時預(yù)測沙生蠟菊與肥胖、心腦血管病變、急性代謝紊亂、動脈硬化、炎癥反應(yīng)和血脂異常等糖尿病相關(guān)并發(fā)癥有關(guān)，且糖尿病并發(fā)癥的靶點關(guān)聯(lián)度更高，其中主要與心血管系統(tǒng)疾病類型的關(guān)聯(lián)度最大，這對接下來的活性方面的驗證提供了思路。此外，沙生蠟菊中的靶點與乳腺癌、前列腺癌等腫瘤類疾病也具有高相關(guān)性，提示沙生蠟菊可能對于腫瘤類疾病有治療作用(圖8)。

圖8 沙生蠟菊T-D網(wǎng)絡(luò)分析圖

2.7 GO生物學(xué)功能分析及KEGG通路富集分析

為了驗證所選的34個靶點是否與糖尿病相匹配，本工作將34個潛在靶點映射到DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov)中，對其生物過程和通路富集進行系統(tǒng)分析(圖9、圖10)。圖9展示了顯著富集的20個生物學(xué)過程，其中有23個基因富集至細胞過程的正調(diào)節(jié)和生物過程的正調(diào)節(jié)，有17個基因富集到細胞代謝過程的正調(diào)節(jié)這一生物學(xué)過程，還有靶點富集至細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、代謝過程的正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，這些生物學(xué)過程都與糖尿病的發(fā)病機制有關(guān)。此外，沙生蠟菊中的潛在靶點還參與含核堿基化合物的代謝過程的正調(diào)控和氮化合物代謝過程的正調(diào)控等生物學(xué)過程。對沙生蠟菊治療T2DM的靶標所參與的主要KEGG通路富集信息進行分析，得沙生蠟菊主要通過調(diào)節(jié)雌激素信號、孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、催乳素信號、癌癥相關(guān)、胰島素信號、VEGF等作用通路發(fā)揮對T2DM的治療作用(圖10)。

Y軸顯示相關(guān)靶基因顯著富集的BP類別，X軸顯示這些條目的富集分數(shù)(P<0.05)。

圖10 沙生蠟菊治療T2DM的靶點KEGG通路富集(P<0.05)

3 討論

本工作建立了完整的蠟菊屬植物的成分數(shù)據(jù)庫，共332個化合物，主要包括黃酮類、酚酸類和糖苷類等。在此基礎(chǔ)上，借助UPLC-Q-TOF-MS表征了沙生蠟菊的化學(xué)成分，分析得到沙生蠟菊中的55個化合物分為6類，建立了沙生蠟菊化合物數(shù)據(jù)庫。在研究了沙生蠟菊化合物數(shù)據(jù)庫的藥動學(xué)特性并篩選出14個相關(guān)活性成分，其中Subscandenin對應(yīng)的靶點數(shù)最多，3,5-二羥基-6,7,8-三甲氧基黃酮、高圣草素和望春花酮A，異綠原酸 A、Tortoside B和蒙花苷對應(yīng)的靶點最少，且化合物山奈酚、柚皮素、芹菜素已被文獻報道具有治療T2MD作用。沙生蠟菊中發(fā)揮治療T2DM的潛在靶點共34個，雖然每個活性化合物相關(guān)靶點的數(shù)量不同，但14個潛在活性化合物之間存在著靶區(qū)重疊，表明不同活性成分可調(diào)節(jié)相似的靶點，發(fā)揮協(xié)同作用。連接化合物或靶點較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵的作用，而ESR1、AR、PPARγ、PTGS2和CA2靶點已被證明與治療糖尿病有關(guān)。除此之外，有29個靶點無相關(guān)實驗研究支持，但卻為沙生蠟菊抗 T2DM機制的研究提供了新的靶點。

預(yù)測沙生蠟菊對T2DM的治療機制可能是通過調(diào)節(jié)雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素信號通路、鈣信號通路等幾個關(guān)鍵通路，均已被證實是治療T2DM的通路。其中雌激素信號通路和PI3K-Akt信號通路包含靶蛋白數(shù)量最多，是沙生蠟菊治療T2DM的關(guān)鍵信號通路。借此，可確認沙生蠟菊對T2DM治療的系統(tǒng)藥理學(xué)分析結(jié)果有一定的準確性。通過T-D網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)沙生蠟菊的活性靶點除與T2DM有相關(guān)性，也與肥胖、心腦血管病變、急性代謝紊亂和血脂異常等糖尿病相關(guān)并發(fā)癥有關(guān)，且與糖尿病并發(fā)癥的靶點關(guān)聯(lián)度更高。此外，沙生蠟菊中的靶點還與乳腺癌、前列腺癌等腫瘤類疾病以及心腦血管疾病也具有高相關(guān)性，GO分析和通路富集分析結(jié)果也輔證了這一結(jié)果。GO分析結(jié)果提示可能具有治療乳腺癌、前列腺癌等腫瘤類疾病，這一結(jié)果與靶點和疾病網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致，提示沙生蠟菊可能對于腫瘤類疾病以及心血管疾病有治療作用，后續(xù)可側(cè)重于關(guān)注沙生蠟菊治療腫瘤類疾病的藥理作用。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)沙生蠟菊可通過調(diào)節(jié)雌激素信號、孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、催乳素信號和癌癥相關(guān)等作用通路發(fā)揮對T2DM的治療作用。系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)果對接下來的活性方面的驗證提供了思路，對所預(yù)測的關(guān)鍵活性成分、治療機制仍需做進一步的實驗驗證。

盡管系統(tǒng)藥理學(xué)在藥物靶點預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)分析藥理機制方面可以提供研究參考，但通常系統(tǒng)藥理學(xué)研究是從參考文獻和在線數(shù)據(jù)庫中收集化合物以生成化合物-靶標圖，因此受到數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)量和全面性的限制，或其中一些具有低生物利用度的化合物也被考慮在內(nèi)產(chǎn)生假陽性結(jié)果[28]。為了改進從參考文獻和在線數(shù)據(jù)庫中收集化合物的方法，以提高系統(tǒng)藥理學(xué)預(yù)測的準確性。提出的解決方法是基于實驗確定中草藥中的化學(xué)成分將減小系統(tǒng)藥理學(xué)預(yù)測潛在化合物的范圍并提高預(yù)測結(jié)果的準確性。LC-Q-TOF-MS可實現(xiàn)對中草藥中化學(xué)成分的快速分析和鑒定，不需要復(fù)雜繁瑣的分離和純化步驟，并具有快速和靈敏的特點。與從參考文獻和在線數(shù)據(jù)庫搜索化合物相比，LC-Q-TOF-MS方法在成分識別方面更為準確和全面。因此，將LC-Q-TOF-MS引入系統(tǒng)藥理學(xué)研究潛在活性成分、靶點和通路相互作用可以克服先前技術(shù)建立化合物數(shù)據(jù)庫不全面和不準確的缺點。通過LC-Q-TOF-MS表征中草藥中化學(xué)成分后所建立的數(shù)據(jù)庫會減小與草藥中實際存在的化合物之間的偏差，使系統(tǒng)藥理學(xué)預(yù)測的靶點和作用機制信息結(jié)果更加準確。

當然，系統(tǒng)藥理學(xué)忽略了活性化合物是否能被吸收入血并代謝，為更準確地確定沙生蠟菊中的生物活性成分并了解其作用機理，可采用LC-Q-TOF-MS法進一步鑒定經(jīng)沙生蠟菊治療后患者血清中吸收的原型成分和代謝物，采用藥動學(xué)方法篩選出具有良好藥動學(xué)性質(zhì)的活性化合物，并進一步對其進行系統(tǒng)藥理學(xué)分析，為深入了解沙生蠟菊治療T2DM的藥理作用機理提供確鑿依據(jù)。

4 結(jié)論

本工作在UPLC-Q-TOF-MS/MS表征沙生蠟菊中的化合物的基礎(chǔ)上，基于系統(tǒng)藥理學(xué)從化合物、作用靶點及信號通路等方面進行探討及分析。選擇以ADME過程中OB≥30%和DL≥0.18作為篩選活性化合物的標準，篩選出14個活性化合物，包括9個黃酮、1個酚酸、2個甾醇和2個其他化合物。預(yù)測出34個潛在的蛋白靶點。根據(jù)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析得出沙生蠟菊活性成分主要與 ESR1、AR、PPARγ等靶點有關(guān)，與雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素信號通路等信號通路相關(guān)，且34個靶標主要富集于大腦、肝臟及骨骼肌中。GO 生物過程富集顯示靶點主要參與細胞過程的正調(diào)節(jié)、生物過程的正調(diào)節(jié)和細胞代謝過程的正調(diào)節(jié)等多種生物過程，KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)沙生蠟菊可通過調(diào)節(jié)雌激素信號、孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、催乳素信號和癌癥相關(guān)等作用通路發(fā)揮對T2DM的治療作用。系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)果對活性方面的驗證提供了思路，然而對所預(yù)測的關(guān)鍵活性成分、潛在靶點及通路仍需做進一步的實驗驗證。

本工作采用LC-Q-TOF-MS共鑒定出沙生蠟菊中的55個化合物，55個化合物的峰面積之和占總峰面積的77.27%，在今后的工作中還需更全面表征沙生蠟菊中的化合物，為深入研究沙生蠟菊提供物質(zhì)基礎(chǔ)信息。本工作為進一步研究沙生蠟菊藥效機制提供了有益參考，同時為如何將 UPLC-Q-TOF-MS/MS 與系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)合提出了思考，并探討了解決方案。