司馬全，王 平，曹林森，徐貴麗

白色念珠菌(Candida albicans，CA)是一種普遍存在的條件性致病菌，也叫白假絲酵母。 白色念珠菌也是目前最主要發(fā)生侵襲性念珠菌感染的病原。 丫蕊花屬(Ypsilandra Franch.)為百合科(Liliaceae Juss.)多年生草本植物,全草具有清熱解毒等功效。甾體皂苷作為丫蕊花的主要活性成分，在近幾年大量研究中發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗菌、止血等多種生理活性。本試驗(yàn)研究丫蕊花皂苷P 的抗白色念珠菌效果。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丫蕊花皂苷P[1]（ypsilandroside P,純度≥97%）,由解放軍920 醫(yī)院藥學(xué)部臨床微生物實(shí)驗(yàn)室前期制備，丫蕊花皂苷P 化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1；氟康唑氯化鈉注射液（fluconazole，F(xiàn)LC），輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：A490705； 注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX），百特國(guó)際有限公司，批號(hào)：6C105A。

圖1 丫蕊花皂苷P 結(jié)構(gòu)式

1.2 供試菌種 實(shí)驗(yàn)菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株：CA(ATCCY0109和ATCCSC5314)采購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。分離耐藥菌株：CA 耐藥菌(CA632、CA592、CA953、CA819、CA152、CA100、CA649、CA956)， 均由第 920醫(yī)院藥學(xué)部臨床微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)巴比賽（BALB/c）小鼠，雌性，6～9 w，18～22 g[昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SYXK（滇）K2015-0002]。 于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥液制備 制備藥液： 將丫蕊花皂苷P 以含10%二甲基亞砜的生理鹽水作為溶劑，配置成濃度為4.096 mg/ml 的藥液。 陽(yáng)性藥液的制備：將氟康唑用生理鹽水配置為16 μg/ml 的藥液以備用。

1.4.2 丫蕊花皂苷P 的最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 參考CLSI 2017 版指南（CLSI:M07-A10, 2017）中微量液體培養(yǎng)基倍比稀釋方法，測(cè)定丫蕊花皂苷P 對(duì)不同的白色念珠菌細(xì)胞的MIC 值。 重復(fù)3 次后數(shù)據(jù)取平均值。

1.4.3 最低殺菌濃度 （MBC） 的測(cè)定 確定MIC后，用接種環(huán)分別蘸取每個(gè)菌種MIC 值前3~5 個(gè)孔的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接種于相應(yīng)的瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)24 h。 用活菌計(jì)數(shù)法檢查瓊脂平板上的菌落，菌落平均數(shù)<5 個(gè)最小藥物濃度即為次藥的MBC。

1.4.4 棋盤(pán)式微量稀釋法[2]采用棋盤(pán)法測(cè)量丫蕊花皂苷P 是否與抗菌藥物有聯(lián)用效果。 將氟康唑與丫蕊花皂苷P 分別于96 孔板上的縱向和橫向兩個(gè)方向分別進(jìn)行倍比稀釋。 將培養(yǎng)板置于35 ℃培養(yǎng)箱中孵育18~24 h 觀察結(jié)果。每組重復(fù)3 次后數(shù)據(jù)取平均值。 部分抑菌濃度及FICI 的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[3-4]。

1.4.5 時(shí)間殺菌曲線法[5]采用時(shí)間- 殺菌曲線法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)棋盤(pán)法所測(cè)定的FICI 的數(shù)值，選擇結(jié)果為相加或協(xié)同作用的組合，進(jìn)一步研究這種化合物和其他抗菌藥之間聯(lián)合的一種動(dòng)態(tài)聯(lián)合殺菌作用。 根據(jù)棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各藥單用及聯(lián)用MIC 設(shè)置各組用藥濃度。 每組重復(fù)3 次后數(shù)據(jù)取平均值。 判斷標(biāo)準(zhǔn)：如兩藥聯(lián)合后，與單用效果最好組比較，降低值＞2 log10CFU/ml，則認(rèn)為二者有協(xié)同作用；降低值為1~2 log10CFU/ml，則認(rèn)為二者為相加作用；降低或增加值為1 log10CFU/ml，則認(rèn)為二者為無(wú)關(guān)作用；若兩藥聯(lián)合使用后增加值大于1 log10CFU/ml，則認(rèn)為兩藥有拮抗作用。

1.4.6 侵襲性白色念珠菌感染模型的建立與評(píng)估[6]巴比賽小鼠隨機(jī)分為環(huán)磷酰胺組和生理鹽水組，每組10 只、環(huán)磷酰胺組給藥方案為：每日腹部注100 mg/kg 環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d 進(jìn)行免疫抑制；生理鹽水組則腹腔注射同劑量的生理鹽水作為對(duì)照。以第1 d 和第4 d 的體重，外周白細(xì)胞數(shù)，脾臟體重系數(shù)作為指標(biāo)，判斷免疫抑制模型建立是否成功。

脾臟體重系數(shù)＝脾臟重量/體重×100（mg/10 g）

1.4.7 丫蕊花皂苷P 給藥生存率評(píng)價(jià) 免疫抑制小鼠隨機(jī)劃分為8 組： 免疫抑制組、 感染對(duì)照組﹑FLC 0.5 mg/kg 組﹑1 mg/kg 組﹑2 mg/kg 組、丫蕊花皂苷 P 0.5 mg/kg 組、1 mg/kg 組、2 mg/kg 組（n=10）。 每只小鼠側(cè)尾靜脈注射0.2 ml 濃度為1×107CFU/ml的菌懸液， 建成侵襲性白色念珠菌感染小鼠模型。感染2 h 后，分組灌胃給藥，每天0.1 ml，免疫抑制組和感染對(duì)照小鼠給予等量生理鹽水， 連續(xù)5 d 給藥，觀察12 d 后小鼠的死亡狀況，繪制生存曲線。

1.4.8 白色念珠菌感染小鼠臟器菌落計(jì)數(shù)[7]將免疫抑制模型小鼠隨機(jī)分為7 組：感染對(duì)照組﹑FLC 0.5 mg/kg 組﹑1 mg/kg 組﹑2 mg/kg 組、 丫蕊花皂苷 P 0.5 mg/kg 組、1 mg/kg 組、2 mg/kg 組。 侵襲性白色念珠菌感染小鼠模型連續(xù)給藥5 d 后脫頸處死各組小鼠（n=6），立即取心臟、肝臟、腎臟并稱(chēng)重后用無(wú)菌玻璃勻漿器勻漿后用0.9%生理鹽水不同稀釋倍數(shù)稀釋后取勻漿液30 μl 涂布于沙氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)板上， 每個(gè)樣品平行3 塊板，35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h 后取出進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 丫蕊花皂苷P 的MIC 和MBC 及與氟康唑聯(lián)合用藥的效果評(píng)價(jià) 丫蕊花皂苷P 對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌（CAY0109、CASC5314）及耐藥菌（CA632、CA592、CA953、CA819、CA152、CA100、CA649、CA956）的 MIC值分布為 2~4 μg/ml，MB (F)C 值分布為 4~8 μg/ml，見(jiàn)表1。 棋盤(pán)法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 時(shí)間殺菌曲線 根據(jù)棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果， 測(cè)試丫蕊花皂苷P 單用、與氟康唑聯(lián)合用藥及氟康唑單用對(duì)用棋盤(pán)法所篩選出的菌株的抗菌效果。 結(jié)果見(jiàn)圖 2（A、B、C）。

表1 丫蕊花皂苷P 單用對(duì)10 種菌株的MIC/MB(F )C 值(n=3)

圖2A 丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CAY0109 時(shí)間殺菌曲線

2.3 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 侵襲性白色念珠菌感染模型的建立與評(píng)估

連續(xù)3 d 腹腔注射100 mg/kg 環(huán)磷酰胺免疫抑制后，各組小鼠體重、白細(xì)胞數(shù)、脾臟系數(shù)如表3、4所示。

圖2B 丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA632 時(shí)間殺菌曲線

圖 2C 丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA152 時(shí)間殺菌曲線

2.3.2 丫蕊花皂苷P 給藥治療白色念珠菌感染小鼠療效觀察 白色念珠菌感染小鼠分組進(jìn)行給藥治療后生存曲線見(jiàn)圖3。

2.3.3 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后臟器菌落計(jì)數(shù) 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后臟器菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖 3（A、B、C）。

3 討論

目前的研究表明，白色念珠菌耐藥性和其機(jī)理可能由于靶酶基因突變或表達(dá)、藥物外排泵基因過(guò)表達(dá)、真菌細(xì)胞膜的通透性變化，使藥物很難進(jìn)入細(xì)胞。 許多研究表明，一些從中藥提取的單體化合物，可以通過(guò)抑制藥物外排泵基因表達(dá)，誘導(dǎo)真菌細(xì)胞內(nèi)的活性氧上升，損傷真菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑菌作用[8]。

表2 棋盤(pán)式微量稀釋法測(cè)定丫蕊花皂苷P 與氟康唑聯(lián)用結(jié)果(n=3)

表3 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型體重與白細(xì)胞數(shù)(,n=10)

表3 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型體重與白細(xì)胞數(shù)(,n=10)

注:與CTX組第1 d 比較,①P < 0.01

生理鹽水組第1 d 19.6±0.5 8.01±0.09 CTX 組第 1 d 19.4±0.6 7.98±0.12生理鹽水組第4 d 19.8±0.4 8.02±0.11 CTX 組第 4 d 16.8±0.5 2.53±0.52

表4 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型脾臟系數(shù)(? s,10)n=

表4 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型脾臟系數(shù)(? s,10)n=

注:與生理鹽水組比較,①P ＜ 0.01

組別 脾臟系數(shù)

圖3 小鼠給藥治療后生存曲線（n=10）

圖4A 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后心臟菌落計(jì)數(shù)

圖4C 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后腎臟菌落計(jì)數(shù)

本實(shí)驗(yàn)研究了丫蕊花皂苷P 抗多個(gè)白色念珠菌菌株的活性。棋盤(pán)法結(jié)果見(jiàn)表2，丫蕊花皂苷P 與氟康唑聯(lián)用時(shí)，對(duì)菌株Y0109、632 及152 有協(xié)同作用。 時(shí)間殺菌曲線結(jié)果如圖2A，丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CAY0109 結(jié)果表明，12 h 時(shí)聯(lián)合用藥與對(duì)照組相比，菌濃度 log10 CFU/ml 降低值＞1，表明聯(lián)合用藥有顯著相加作用；如圖2B，丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA632 結(jié)果表明，12 h 時(shí)聯(lián)合用藥與對(duì)照組相比，菌濃度 log10 CFU/ml 降低值＞2，表明聯(lián)合用藥有顯著相協(xié)同作；如圖2C，丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA152 結(jié)果表明，24 h 時(shí)聯(lián)合用藥組與單用組相比，菌濃度log10 CFU/ml 降低值>2，故兩者聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。其中兩者聯(lián)合抗CAY0109 和抗CA632 的效果于12 h 左右最佳，而后隨時(shí)間增長(zhǎng)抗菌效果也逐漸消失，這可能是由于聯(lián)合抗菌用藥濃度較低導(dǎo)致。 且丫蕊花皂苷與P 氟康唑聯(lián)用時(shí)的氟康唑MIC 均比氟康唑單用時(shí)的MIC 有所降低，說(shuō)明丫蕊花皂苷P 有一定的抗耐藥效果。

侵襲性白色念珠菌感染模型建立實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 連續(xù)3 d 腹腔注射100 mg/kg 環(huán)磷酰胺免疫抑制后， 環(huán)磷酰胺組小鼠的體重與第1 d 相比顯著減輕(P< 0.01)，而生理鹽水小鼠的第4 d 和第1 d 相比沒(méi)有明顯的體重差異， 見(jiàn)表4； 小鼠白細(xì)胞數(shù)(white blood cell,WBC )結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺組小鼠的白細(xì)胞數(shù)在第4 d 和第1 d 相比明顯減少(P<0.01)，而生理鹽水組小鼠第4 d 與第1 d 相比白細(xì)胞數(shù)與無(wú)顯著性差異；脾臟的體重系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表5，第4 d環(huán)磷酰胺組和生理鹽水組的脾臟重量系數(shù)比，前者脾臟的體重系數(shù)明顯下降(P< 0.01)。 參照文獻(xiàn)[8]，小鼠的白細(xì)胞數(shù)連續(xù)3 d 下降70%， 表明免疫抑制的成功，即連續(xù)3 d 每日腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg可以成功地對(duì)小鼠實(shí)施免疫抑制。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各組小鼠中位生存時(shí)間分別為：感染對(duì)照組 5 d﹑FLC 0.5 mg/kg 組 7 d﹑FLC 1 mg/kg 組 10 d、丫蕊花皂苷 P 0.5 mg/kg 組 5 d、丫蕊花皂苷P 1 mg/kg 組6 d、丫蕊花皂苷P 2 mg/kg 組8 d。與感染對(duì)照組相比，F(xiàn)LC 0.5 mg/kg 組和FLC 1 mg/kg組小鼠生存率提高、中位生存時(shí)間延長(zhǎng)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P< 0.01）；丫蕊花皂苷P 各組小鼠的中位生存時(shí)間均較感染對(duì)照組有所延長(zhǎng)，但只有丫蕊花皂苷P 2 mg/kg 組小鼠的中位生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明丫蕊花皂苷P 在體內(nèi)具有抗白色念珠菌活性。

在臟器菌落計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 給藥治療后，各臟器中1 mg/kg FLC 及2 mg/kg FLC 組的菌落數(shù)與對(duì)照組相比顯著下降，且差異隨給藥劑量的增大而增大。 在肝臟中3 個(gè)劑量濃度的丫蕊花皂苷P 與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），在心臟和腎臟中只有2 mg/kg 丫蕊花皂苷P 與對(duì)照組相比菌落數(shù)降低（P< 0.01）。

白色念珠菌耐藥卻是一種復(fù)雜的多因素作用過(guò)程，它涉及到多個(gè)因素的參與，丫蕊花皂苷P 具體的抗菌機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。