杜素琴 祝 幸 于 艷 劉祎琪 黃京京 諸欣平 程喻力

(首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體寄生蟲學教研室，北京100069)

在蠕蟲與宿主共進化歷程中，蠕蟲通過誘導宿主免疫細胞膜表面表達一些具有負調節(jié)作用的抑制性受體以調節(jié)宿主免疫反應。宿主因感染所致的這些抑制性受體的表達，一方面利于蠕蟲在宿主體內的長期生存，另一方面通過限制過度活化的免疫反應而對感染所致炎性損傷具有一定保護作用(Wammesetal., 2016)。其中，程序性死亡分子1(programmed death-1，PD-1)作為CD28家族分子之一，是一種重要的抑制性跨膜蛋白，可表達于活化的T細胞、B細胞和單核/巨噬細胞，通過與其配體PD-L1或PD-L2結合，在慢性感染中發(fā)揮重要免疫調節(jié)作用(Bucktroutetal., 2018)。

旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis，T.spiralis)簡稱旋毛蟲，是一種組織內寄生的蠕蟲，由該蟲引起的旋毛蟲病(trichinellosis)是一種常見的食源性人獸共患寄生蟲病，嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(Rawlaetal., 2020)。旋毛蟲感染可分為腸道期和肌肉期，在感染的不同時期，成蟲和幼蟲分別侵入不同組織所致的免疫病理損傷是旋毛蟲致病的主要因素。腸道期主要發(fā)生在感染后第1周，因成蟲和新生幼蟲侵入腸粘膜引起十二指腸和空腸的廣泛炎癥；肌肉期主要發(fā)生在感染3周后，因新生幼蟲隨血液和淋巴移行至骨骼肌嚴重破壞肌纖維，并引起寄生局部炎性細胞浸潤及纖維組織增生(Wilsonetal., 2015)。目前，PD-1在旋毛蟲感染所致宿主組織免疫病理損傷中的免疫調節(jié)作用尚不清楚。本研究利用PD-1基因缺失(PD-1-/-)小鼠，觀察PD-1缺失對旋毛蟲感染腸道期和肌肉期組織病理學改變的影響，為闡明PD-1在旋毛蟲感染所致宿主組織病理損傷中的調節(jié)作用提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及蟲株

實驗動物：SPF級野生型(wild type，WT) C57BL/6小鼠(雄性，6～8周齡)，購自北京維通利華有限公司。SPF級C57BL/6遺傳背景 PD-1-/-小鼠 (雄性，6～8周齡)，購自美國杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory)。旋毛蟲蟲株：源自本實驗室 ICR小鼠傳代保種的黑龍江豬源旋毛蟲 (ISS 533)。

1.2 實驗分組及動物感染

將C57BL/6小鼠隨機分為4組：WT未感染組、WT感染組(WT+TS)、PD-1-/-未感染組(KO)、PD-1-/-感染組(KO+TS)。另取旋毛蟲感染ICR保種小鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，去除小鼠的頭部、皮毛和內臟、脂肪，分離出剩余肌肉后，用胃蛋白酶消化法消化，收集肌幼蟲，并混懸于4%明膠，定量計數(shù)后，以400條肌幼蟲/鼠經口灌胃感染各組小鼠。

1.3 組織病理學觀察

1.3.1腸組織病理學觀察: 于感染后第6 d(腸型期)處死小鼠，沿胃幽門下剪取小腸上段腸組織約1 cm；將上述組織置10%中性甲醛固定24～48 h后，脫水、浸蠟、包埋，制作4 μm厚切片，脫蠟后用蘇木精—伊紅染色(HE染色)，脫水封片，顯微鏡下觀察。利用全自動切片掃描儀掃描切片，Case Viewer軟件隨機選擇3個以上相同大小的視野，計算炎性細胞數(shù)/組織面積(cells/mm2)及腸絨毛長度/隱窩長度的比值(crypts length/villi length，V/C)，求平均值。

1.3.2肌組織病理學觀察: 于感染后第28 d(肌型期)、42和60 d處死小鼠，解剖剪取小鼠膈肌。制作石蠟切片方法同上。分別進行HE染色(感染后第28、42和60 d)和Masson染色(第60 d)，顯微鏡下觀察。利用全自動切片掃描儀掃描切片，Case Viewer軟件隨機選擇3個以上相同大小的視野，用image pro plus6軟件來計數(shù)HE染色切片中炎性細胞，按炎性細胞數(shù)/組織面積(cells/mm2)求平均值；用StrataQuest v.6軟件來統(tǒng)計Masson染色切片中每個囊胞周圍組織纖維化面積。

1.4 統(tǒng)計學分析

以上數(shù)據(jù)分析采用SPSS17. 0軟件進行單因素檢驗分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤表示，且來源于3次獨立實驗，*P< 0.05；**P< 0.01；***P< 0.001，且P< 0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-1對旋毛蟲感染小鼠腸組織病理學改變的影響

為研究PD-1在旋毛蟲感染腸型期組織病理學改變中的作用，于感染后第6 d對比觀察 WT小鼠和PD-1-/-小鼠小腸組織病理學改變。小腸石蠟切片HE染色結果顯示，與未感染組相比，旋毛蟲感染WT小鼠及PD-1-/-小鼠均表現(xiàn)為小腸腸絨毛縮短、糜爛，腸隱窩加深，且腸絨毛長度/隱窩的長度(V/C)的比值均明顯降低(P<0.001)，但WT感染小鼠與PD-1-/-感染小鼠兩組之間V/C比值無明顯差異(P>0.05)；另外，WT感染小鼠及PD-1-/-感染小鼠粘膜及粘膜下層均有大量炎性細胞浸潤，黏膜損傷加重，并伴有水腫，但兩組之間腸組織浸潤炎性細胞數(shù)量無明顯差異(P> 0.05)(圖1，箭頭所指為炎性細胞)。該結果表明，PD-1缺失對旋毛蟲感染小鼠腸型期組織病理學改變無明顯的影響。

圖1 旋毛蟲感染小鼠腸組織切片HE染色Fig.1 Intestinal tissue sections of mice infected with T. spiralis(HE staining)Control: 未感染組；Infection: 感染組；WT：WT未感染組；KO：PD-1-/-未感染組；WT+TS：WT感染組；KO+TS: PD-1-/-感染組。A：腸道HE染色；B：腸絨毛長度/腸隱窩深度的比值(V/C)；C：腸組織粘膜及粘膜下層炎性細胞的浸潤。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，* P< 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：表示差異無統(tǒng)計學意義。Control：Non-infected group; Infection：Infected group; WT：Non-infected WT mice； KO： Non-infected PD-1-/- mice；WT+TS：WT mice infected with T. spiralis；KO+TS：PD-1-/- mice infected with T. spiralis. A：HE staining of intestinal; B：Ratio of intestinal villi length (V) to intestinal recess length (C); C：Inflammatory cells into the mucosa and submucosa of intestinal tissue. Value represent mean ± SD, * P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：Not significant．

2.2 PD-1對旋毛蟲感染小鼠肌肉組織病理學改變的影響

為研究PD-1在旋毛蟲感染肌型期組織病理學改變中的作用，分別于感染后第28、42和60 d通過HE染色對比觀察旋毛蟲感染WT小鼠和PD-1-/-小鼠肌幼蟲囊包周圍肌組織病理學改變，于感染后第60 d通過Masson染色觀察囊包周圍組織纖維化水平。HE染色結果顯示，未感染WT小鼠和PD-1-/-小鼠肌纖維正常、排列整齊，橫紋較清晰；而WT感染小鼠肌肉組織中幼蟲囊包周圍部分肌纖維腫脹、排列紊亂、橫紋有不同程度的消失，且間質有輕度水腫和不同程度的炎性細胞浸潤，感染后第28 d幼蟲囊包周圍浸潤的炎性細胞數(shù)量較高，隨感染時間的延長，炎性細胞浸潤數(shù)量逐漸下降。PD-1-/-感染小鼠肌肉組織中幼蟲囊包周圍肌纖維腫脹程度較WT感染小鼠更為嚴重，排列明顯紊亂，且部分肌纖維甚至發(fā)生斷裂，幼蟲囊包周圍炎性細胞浸潤數(shù)量在各時間點均明顯高于WT小鼠(P< 0.05)。另外，PD-1-/-感染小鼠單位視野中肌幼蟲囊包數(shù)量明顯多于WT小鼠(圖2)。該結果表明，PD-1缺失可促進幼蟲在肌組織的寄生，并促進肌組織中幼蟲寄生所致的炎性細胞浸潤，加重肌肉炎性損傷。Masson染色結果顯示，未感染WT小鼠和PD-1-/-小鼠肌組織無纖維化。旋毛蟲感染第60d，PD-1-/-小鼠每囊包周圍肌組織纖維化面積均值明顯小于WT小鼠，表明PD-1缺失能抑制幼蟲囊包周圍肌組織纖維化(圖3)。

圖2 旋毛蟲感染小鼠膈肌組織切片HE染色Fig.2 The diaphragmatic tissue sections of mice infected with T. spiralis(HE staining)A：膈肌組織切片HE染色，感染后第0、28、42、60 d(0day、28day、42day、60day)；B：膈肌組織囊包周圍炎性細胞的浸潤數(shù)量；C：每個視野的囊包數(shù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，* P< 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：表示差異無統(tǒng)計學意義，下同。A：H&E staining of diaphragm tissue sections, 0, 28, 42, and 60 days after infection (0day, 28day, 42day, 60day)；B：The number of inflammatory cells around the cysts；C：Number of follicles per field. Value represent mean ± SD, * P<0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001，ns：Not significant. The same below.

圖3 旋毛蟲感染小鼠膈肌組織切片Masson染色Fig.3 The diaphragmatic tissue of mice infected with T. spiralis(Masson staining)A：感染后60 d小鼠膈肌組織切片Masson染色情況；B：每個囊包周圍組織藍色區(qū)域面積。A：Masson staining of diaphragmatic muscle tissue of mice 60 days after infection；B：The blue area around per cyst(Total blue area/cysts).

3 討論

在慢性感染過程中，病原體誘導宿主抑制性共刺激分子的表達對于維持機體免疫平衡具有重要作用。PD-1作為一種重要的抑制性分子對病原體感染所致免疫病理反應具有調節(jié)作用(Karunarathneetal., 2016; Hoogeveenetal., 2019)。已有研究報道，PD-1介導的免疫調節(jié)作用能抑制蠕蟲感染所致的病理性免疫反應的發(fā)生發(fā)展。例如，在血吸蟲慢性感染小鼠模型中利用抗體阻斷PD-1信號可增強蟲卵所致的肝臟免疫病理反應(Zhouetal., 2016)；利用PD-L2基因缺失小鼠建立慢性肝片形吸蟲感染小鼠模型發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1/PD-L2信號可加重肝臟的炎性損傷(Stempinetal., 2016)。然而，不同蟲種經PD-1調節(jié)宿主免疫病理反應的機制不盡一致。

在旋毛蟲感染腸型期，由于脫囊幼蟲與雌成蟲侵入腸黏膜，加之蟲體排泄分泌物及產出的大量新生幼蟲的刺激，導致腸絨毛縮短，隱窩加深，黏膜下層伴有大量炎性細胞浸潤(Zhuetal., 2018)。本研究結果與之相一致，WT組小鼠在感染后腸組織V/C比值降低，且表現(xiàn)為明顯的炎癥反應。而旋毛蟲感染PD-1-/-小鼠的V/C比值及小腸組織炎癥細胞浸潤數(shù)量較WT小鼠均無顯著差異，提示PD-1對旋毛蟲感染小鼠腸型期腸組織病理學改變無明顯影響。在旋毛蟲感染肌型期，幼蟲移行至橫紋肌后，導致肌纖維嚴重破壞以及肌組織中幼蟲囊包的形成，這種特異性的病理變化是宿主抗旋毛蟲免疫反應的結果(Renetal., 2018)。本研究通過HE染色動態(tài)觀察WT小鼠旋毛蟲感染后28～60 d小鼠膈肌組織病理學變化，結果顯示感染第28 d炎性細胞浸潤數(shù)量最多，而隨感染時間的延長肌組織囊包幼蟲周圍的炎性細胞浸潤逐漸減少。感染第60 d Masson染色結果顯示，囊包周圍肌組織出現(xiàn)明顯的纖維化囊壁，提示肌膜周圍纖維結締組織發(fā)生增生修復。而PD-1-/-感染小鼠肌組織中囊包數(shù)及炎性細胞浸潤數(shù)量在感染后各時間點均明顯高于WT小鼠，而單個囊包周圍纖維化面積均值明顯低于WT小鼠，提示PD-1介導的免疫調節(jié)作用能抑制幼蟲在肌組織的寄生及其所致的免疫病理反應，并在感染后期促進了幼蟲囊包周圍組織的纖維化。上述結果證實PD-1在旋毛蟲感染免疫中具有一定免疫保護作用。早期研究認為，PD-1主要表達于活化的T細胞表面，通過與抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)膜表面相應的配體PD-L結合而向T細胞傳遞抑制性信號，導致效應T細胞失活，且增殖受限，從而發(fā)揮免疫負調節(jié)作用(Bishopetal., 2009; Chikumaetal., 2009; Franciscoetal., 2009)。近年研究表明，PD-1/PD-L信號通路對病原誘導宿主的免疫反應類型也具有一定調節(jié)作用。已有研究證實，PD-1可促進蠕蟲感染所致的Th2型免疫反應(van der Werfetal., 2013; Schwartzetal., 2017; Wangetal., 2018)。我們前期利用PD-1-/-小鼠研究發(fā)現(xiàn)，PD-1缺失條件下旋毛蟲誘導小鼠CD4+T細胞向Th2細胞分化的作用顯著下降(Chengetal., 2018)。由于蠕蟲誘導宿主產生的2型免疫反應一方面發(fā)揮抗蟲免疫保護作用，另一方面對感染所致宿主的免疫病理損傷具有限制和修復作用(Gauseetal., 2013)，據(jù)此，我們推測PD-1-/-小鼠較WT小鼠肌幼蟲囊包數(shù)顯著增多、肌組織炎癥反應的加重以及纖維化水平的下降可能與Th2型免疫反應水平的下降有關。然而，本研究發(fā)現(xiàn)PD-1-/-和WT小鼠腸組織病理改變無明顯區(qū)別，這可能與感染早期WT小鼠和PD-1-/-小鼠Th2型免疫反應尚無明顯差異有關。

綜上所述，本研究證實PD-1對旋毛蟲感染腸型期組織病理學改變無明顯影響，但對肌型期幼蟲生存及肌組織炎癥反應具有一定抑制作用，而旋毛蟲經PD-1抑制旋毛蟲感染肌幼蟲所致組織病理學改變的免疫學機制有待進一步證實。