劉鵬波 張耀文 趙 艷 郁春云 曹雅明

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110122)

瘧疾是由瘧原蟲(chóng)感染所引起的一種古老的嚴(yán)重危害人體健康的蟲(chóng)媒疾病(周吉坤等，2015)。僅在2018年，全世界大約有2.28億例瘧疾感染病例，其中有40.5萬(wàn)人死于瘧疾。感染人類的多種瘧原蟲(chóng)中，間日瘧原蟲(chóng)在全球范圍內(nèi)的分布最廣，且在非洲以外地區(qū)的感染病例最多(WHO，2020)。間日瘧原蟲(chóng)具有復(fù)雜的生物學(xué)特性，感染早期配子體在出現(xiàn)癥狀前就出現(xiàn)在外周血使其擁有更長(zhǎng)的傳播窗口期。同時(shí)，它具有侵染網(wǎng)織紅細(xì)胞的傾向性，因此很難獲得體外連續(xù)培養(yǎng)，使開(kāi)發(fā)有效的抗瘧措施是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的任務(wù)。此外，有研究證據(jù)表明，間日瘧原蟲(chóng)在中緬邊境流行區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)氯喹等抗瘧藥物敏感性降低的現(xiàn)象(胡月，2016)。間日瘧原蟲(chóng)在與惡性瘧原蟲(chóng)共同流行地區(qū)的優(yōu)勢(shì)地位日益增強(qiáng)，突出了針對(duì)間日瘧原蟲(chóng)開(kāi)發(fā)新控制措施的必要性，包括開(kāi)發(fā)出高效的疫苗等。然而，與惡性瘧原蟲(chóng)相比，間日瘧原蟲(chóng)疫苗的研發(fā)依然處于早期臨床前階段，疫苗新的候選抗原篩選依然是當(dāng)前工作的重心。而在間日瘧原蟲(chóng)感染早期不斷產(chǎn)生有性階段的雌、雄配子體對(duì)其實(shí)現(xiàn)有效的傳播至關(guān)重要，這說(shuō)明針對(duì)瘧原蟲(chóng)有性階段的傳播阻斷疫苗可能是消滅間日瘧在人群中傳播的一項(xiàng)重要措施。

傳播阻斷疫苗以瘧原蟲(chóng)有性階段以及按蚊中腸期蛋白為抗原。但目前為止，雖然研究了較多的傳播阻斷疫苗的候選抗原，但其中僅有一小部分表現(xiàn)出來(lái)傳播阻斷活性(TRA)。傳播阻斷疫苗的發(fā)展目前主要集中在瘧原蟲(chóng)生命周期中的3個(gè)階段，包括受精前抗原Pfs230(Farranceetal.，2011)和Pfs48/45(Outchkourovetal.，2008)，受精后抗原Pfs25(Wuetal.，2008)和Pfs28(Duffyetal.，1997)以及蚊中腸抗原AgAPN1(Dinglasanetal.，2007)。

最近研究表明，HAP2/GCS1蛋白具有成為新一代TBV候選抗原的潛質(zhì)。HAP2/GCS1蛋白最初于擬南芥中發(fā)現(xiàn)(von Besseretal.，2006)，并且廣泛存在于包括植物、多細(xì)胞生物、無(wú)脊椎動(dòng)物、藻類以及致病性和非致病性原生生物在內(nèi)的多種真核生物中。HAP2是由單一的跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外結(jié)構(gòu)域和相對(duì)較短的胞內(nèi)區(qū)所構(gòu)成的高度保守的蛋白(Fédryetal.，2017, Fedryetal.，2018)。在對(duì)衣藻、擬南芥和四膜蟲(chóng)HAP2的結(jié)構(gòu)和功能研究表明，HAP2是一種配子膜融合蛋白，與Ⅱ類病毒融合蛋白同源(Fédryetal.，2017, Pinelloetal.，2017, Fengetal.，2018)。在膜融合的過(guò)程中，一個(gè)由～40氨基酸(AA)保守區(qū)組成的疏水環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要的作用(Fédryetal.，2017)。HAP2存在于所有瘧原蟲(chóng)的基因組中，伯氏瘧原蟲(chóng)PbHAP2基因的破壞可以阻止按蚊中腸雌、雄配子的受精和隨后在按蚊中的發(fā)育(Hiraietal.，2008, Liuetal.，2008)。PbHAP2是一種在雄性配子表面表達(dá)的雄性生育因子，為雌性和雄性配子膜融合所必需(Hiraietal.，2008, Liuetal.，2008)。雖然PbHAP2僅參與了配子的融合，并未參與雌、雄配子的黏附結(jié)合過(guò)程，同時(shí)抗PbHAP2抗體可在體內(nèi)、外引起較強(qiáng)的傳播阻斷效應(yīng)(TRA)(Blagboroughetal.，2009)。在小麥胚芽無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的PfHAP2重組蛋白免疫小鼠后，得到的抗體在標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)中也顯示出強(qiáng)大的TRA(Miuraetal.，2013)效應(yīng)。研究表明，針對(duì)保守的HAP2 cd環(huán)肽的抗體在伯氏瘧原蟲(chóng)和惡性瘧原蟲(chóng)系統(tǒng)中均顯示出有效的TRA(Angrisanoetal.，2017) 效應(yīng)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)參與瘧原蟲(chóng)配子受精過(guò)程的II類融合蛋白是TBV的潛在候選抗原。

前期結(jié)果顯示，通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PvHAP2蛋白的抗體表現(xiàn)出了較為明顯的傳播阻斷效應(yīng)，表明PvHAP2具有作為傳播阻斷疫苗候選抗原的潛能。然而，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高昂的代價(jià)明顯不適合大規(guī)模蛋白表達(dá)，在一定程度上制約了其作為疫苗抗原生產(chǎn)系統(tǒng)的可行性。為進(jìn)一步闡明不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rPvHAP2蛋白所制備抗體的傳播阻斷活性，本文通過(guò)間日瘧原蟲(chóng)重組rPvHAP2蛋白的原核表達(dá)和抗體血清制備，探討其抗血清對(duì)間日瘧原蟲(chóng)的傳播阻斷活性，結(jié)果證實(shí)了PvHAP2在間日瘧原蟲(chóng)中的表達(dá)和定位情況，并初步揭示其作為傳播阻斷候選抗原的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用的間日瘧原蟲(chóng)臨床分離株取自中緬邊境間日疾患者，6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。斯氏按蚊Anophelesstephensi由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室恒溫飼養(yǎng)。主要試劑辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和鼠抗His-tag單抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、鎳氨三乙酸瓊脂糖柱、肝素鈉及其余常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。限制性內(nèi)切酶BamH IXhoL I購(gòu)買自美國(guó)NEB公司；血液基因組DNA提取試劑盒選自北京天根生化科技有限公司。DNA純化試劑盒(TaKala Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0)購(gòu)買于日本TaKala公司。

1.2 目的基因的擴(kuò)增以及原核表達(dá)載體pET32a-PvHAP2的構(gòu)建

為表達(dá)重組蛋白rPvHAP2，在蛋白區(qū)域(231-459 aa)選取了一段229 aa的片段通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。針對(duì)表達(dá)的片段以及原核表達(dá)載體 pET32α(+)合理設(shè)計(jì)合成引物PvHAP2-F(5′-caGGATCCGTGCCATCATGGATTTCTCC-3′)和PvHAP2-R(5′-ggCTCGAGAATAATTAACACATTTTTTCA-3′)并在稀釋后用間日瘧原蟲(chóng)基因組充當(dāng)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括 1.5 μL 10 μmol/L引物PvHAP2-F，1.5 μL 10 μmol/L引物PvHAP2-R，5 μL 2 mmol/LdNTPs，5 μL 10×buffer，3 μL 25 mmol/L MgSO4，2 μL DNA模板，1 μL PCR-Plus-Neo，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序如下:先于98 ℃ 預(yù)熱2 min；然后98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)產(chǎn)物的大小切下目的基因片段，并按DNA純化試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的回收。之后用BamH Ι和XhoL I限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)回收所得的目的基因和原核表達(dá)載體pET32a(+)進(jìn)行雙酶切處理并回收純化，之后用T4 DNA連接酶將回收的片段克隆至原核表達(dá)載體pET32α(+)中。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌DH5α中，采用菌體 PCR 的方法鑒定陽(yáng)性克隆，并挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，在雙酶切鑒定后送北京華大基因測(cè)序，用DNA Star軟件進(jìn)行序列比對(duì)后，保存菌種備用。

1.3 重組蛋白rPvHAP2的表達(dá)和純化

1.3.1重組蛋白rPvHAP2的表達(dá)：凍存的菌液3 μL接種于3 mL新鮮的LB培養(yǎng)基，加入氨芐抗生素后于 37 ℃下?lián)u菌過(guò)夜，次日提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入RGB原核表達(dá)宿主菌中。菌落PCR鑒定正確后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的300 mL LB培養(yǎng)基，在37 ℃進(jìn)行搖菌,當(dāng)菌液OD值達(dá)到 0.4～0.6 時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于19 ℃誘導(dǎo)8 h，10 000 r/min離心10 min收菌。向收集的菌體加入1×Ni-NTA 結(jié)合緩沖液重懸后在冰上進(jìn)行超聲破菌(540 W超聲2 s，間隔3 s，全程時(shí)間20 min),破菌后的菌液在 4 ℃ 條件下12 000 r/min離心5 min，收取上清液樣品。

1.3.2上清蛋白純化：取5 mL 50%鎳氨三乙酸瓊脂糖柱Ni-NTA His·Bind Superflow懸液加入到20 mL 1×Ni-NTA 結(jié)合緩沖液中，輕輕混勻，在3 000 r/min離心5 min，吸去上清，重復(fù)2遍，以激活Ni-瓊脂糖。加入經(jīng)過(guò)無(wú)菌0.22 μm濾器推濾的20 mL rPvHAP2蛋白表達(dá)后的上清液，在恒溫?fù)u床上輕輕搖動(dòng)混勻,于4 ℃結(jié)合60 min。加入5倍柱體積的1×Ni-NTA 洗雜緩沖液(含300 mmol/L NaCl與50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)在混合器上洗滌10 min，此步驟重復(fù)3～4次。棄去洗雜緩沖液后用10 mL 1×Ni-NTA 洗脫緩沖液(300 mmol/LNaCl與50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)進(jìn)行蛋白洗脫，收集蛋白。將洗脫后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的 PBS 緩沖液中4℃進(jìn)行梯度透析。

1.4 SDS-PAGA電泳和Western blot檢測(cè)

將純化后的rPvHAP2蛋白樣品以每孔4 μg進(jìn)行上樣。用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定蛋白的純化情況，濃縮膠在60 V電壓下進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)竭_(dá)分離膠后，將電壓調(diào)到100 V，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，脫色之后于凝膠成像分析儀上進(jìn)行觀察，從而分析蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化情況。

純化的重組蛋白用10%的SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后，在4 ℃ 45 V恒壓轉(zhuǎn)膜3 h將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上。以5%(m/V)的TBST(0.1 mol/L TBS, pH 7.4, 0.02% Tween 20)溶解脫脂奶粉在4 ℃封閉2 h。經(jīng)TBST洗3次后，1∶2000稀釋的鼠抗His-tag單抗(5%脫脂奶粉稀釋)與PVDF膜4℃結(jié)合過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5 min，1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(TBST稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL發(fā)光的方法在熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測(cè)。

1.5 多克隆抗體制備及血清抗體滴度檢測(cè)

為了獲得針對(duì)重組PvHAP2蛋白的抗血清，用50 μg的上述重組蛋白與弗氏完全佐劑充分混合后通過(guò)皮下注射的方式對(duì)BALB/c 雌性小鼠進(jìn)行免疫，分別于第3、5周給予兩次加強(qiáng)免疫，免疫方法為25 μg的PvHAP2 重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合后進(jìn)行皮下免疫。于末次免疫后第7 d收集血清檢測(cè)抗體滴度。多克隆抗體通過(guò)蛋白質(zhì)A柱經(jīng)行收集。用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋重組蛋白rPvHAP2(5 μg/mL)包被96孔酶標(biāo)板，并于4 ℃過(guò)夜。經(jīng)200 μL PBST(0.1 mol/L PBS，pH 7.4，0.02% Tween 20)洗板3次后，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉液在37 ℃ 封閉1 h。用PBST 洗3次后，加入用封閉液稀釋的血清(稀釋倍數(shù)從 1∶200 到 1∶25600)，每孔100 μL，于37 ℃孵育2 h。PBST 洗板 3 次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1∶5000)，37 ℃ 孵育2 h。PBST洗板7次后，加入底物鄰苯二胺和過(guò)氧化氫進(jìn)行顯色，100 μL稀H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。

1.6 間接免疫熒光測(cè)定(IFA)

在中緬邊境通過(guò)顯微鏡鏡檢瘧原蟲(chóng)的方法招募間日瘧原蟲(chóng)患者。在獲得書面知情同意(Human Subject Assurance Number：FWA0001184)后，每名患者抽取5 mL靜脈血，并在37℃下立即與2倍體積的懸浮緩沖液(10 mmol/L Tris，pH 7.4，170 mmol/L NaCl，10 mmol/L葡萄糖)進(jìn)行充分混合，以避免雄配子體出絲。離心除去上清液后，將紅細(xì)胞沉淀重懸于10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基中。用47%Nycodenzs/RPMI 1640于500×g離心25 min以對(duì)重懸液進(jìn)行分離。收集灰色界面處富含配子體細(xì)胞的組分，并用RPMI 1640洗滌3次。將分離出的配子體細(xì)胞點(diǎn)到多孔載玻片上，并用4%多聚甲醛和0.0075%戊二醛(Sigma)固定30 min。用甘氨酸/PBS(3.75 mg/mL)中和固定液中醛基后，0.1% Triton X-100 透膜10 min。PBS洗滌后，用3%BSA/PBS溶液于37℃封閉30 min。經(jīng)PBS洗滌后，加入抗PvHAP2血清純化的IgG(1∶500)孵育1 h。PBS洗滌后，將玻片與Alexa Fluor?488山羊抗鼠IgG抗體(1∶500)和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)在37℃孵育1 h。PBS洗滌后，將載玻片用ProLong防淬滅試劑盒固定，并使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。免疫前血清用作IFA的陰性對(duì)照。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)(SMFA)

在中緬邊境招募間日瘧感染的患者，在知情同意后，每個(gè)患者取10 mL的血液進(jìn)行SMFA以評(píng)估抗PvHAP2抗體的傳播阻斷效果。純化的抗PvHAP2的IgG用來(lái)自泰國(guó)志愿者的AB+人血清(熱滅活去除補(bǔ)體后)以1∶1進(jìn)行稀釋，共180 μL。然后將稀釋的IgG(11.7 μg/μL)樣品與患者的紅細(xì)胞混合(1∶1)，并在37℃孵育15 min后將混勻血液樣品加入膜進(jìn)樣器。每個(gè)樣品，由實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的50只饑餓的按蚊通過(guò)進(jìn)樣器進(jìn)食30 min。喂食后，將未進(jìn)食的按蚊去除，吸飽的按蚊飼養(yǎng)于溫度為27℃，80%相對(duì)濕度條件下，給予10%蔗糖水。在第7 d每組解剖20只按蚊得到蚊中腸，用0.5%汞色素染色后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)在按蚊中腸上形成的卵囊數(shù)量。對(duì)照組用免疫前血清純化的IgG作對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析對(duì)照組和PvHAP2 免疫組兩組按蚊的卵囊數(shù)之間的差異。Student′st檢驗(yàn)分析ELISA檢測(cè)抗體滴度。按蚊感染率的計(jì)算方法為卵囊陽(yáng)性按蚊在被解剖的全部按蚊中所占的百分比。Fisher′s的精確檢驗(yàn)用于比較對(duì)照組和PvHAP2免疫組之間的感染率差異。P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-PvHAP2重組蛋白的表達(dá)

HAP2/GCS1的結(jié)構(gòu)域具有重要功能，因此，我們選取了PvHAP2的229個(gè)氨基酸片段(231-459 aa)，它包含7個(gè)半胱氨酸但沒(méi)有cd環(huán)的結(jié)構(gòu)域。通過(guò)PCR的方法成功擴(kuò)增得到了PvHAP2基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoL I進(jìn)行雙酶切后連接至線性化的pET32α載體(圖1)，經(jīng)華大測(cè)序正確后，凍菌備用。

圖1 pET32α-PvHAP2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖Fig.1 The protocol for recombinant pET32α-PvHAP2 plasmidA. pET32α原核表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜；B.擴(kuò)增的PvHAP2基因的DNA片段；C.構(gòu)建好的pET32α-PvHAP2原核表達(dá)載體.A. The plasmid map of pET32α prokaryotic expression vector; B. The amplified DNA fragment of PvHAP2 gene; C. The constructed vector of pET32α-PvHAP2.

pET32α-PvHAP2表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，菌體超聲破碎后。使用His-tag鎳氨三乙酸瓊脂糖柱純化重組蛋白，并對(duì)洗脫及透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，可清晰看到目標(biāo)蛋白條帶，蛋白純度達(dá)到80%以上。同時(shí)使用Western blot對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了重組蛋白的正確表達(dá)(圖2)。

圖2 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot analysis of purified rPvHAP2 proteinM：蛋白 Marker；Cont：未誘導(dǎo)菌液.M: Protein marker; Cont: Bacterial liquid without induction.

2.2 ELISA檢測(cè)血清的抗體滴度

三次免疫后，通過(guò)眼球取血獲得免疫后的血清純化IgG。經(jīng)ELISA檢測(cè)表明，小鼠對(duì)重組PvHAP2蛋白具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。抗體滴度明顯高于對(duì)照組，第3次免疫后抗體滴度達(dá)到1∶25600(圖3)。結(jié)果表明，重組PvHAP2具有較好的免疫原性，可誘導(dǎo)雌性BALB/c 小鼠產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答。

圖3 抗PvHAP2 IgG抗體滴度檢測(cè)Fig.3 The antibody titer of purified anti-PvHAP2 IgG

2.3 間接免疫熒光檢測(cè)蛋白定位

為確定PvHAP2的表達(dá)和定位，在中緬邊境招募間日瘧患者收集血液樣本后，使用密度梯度離心法分離得到間日瘧原蟲(chóng)配子體進(jìn)行IFA。結(jié)果表明對(duì)照組血清與配子體無(wú)反應(yīng)，而抗PvHAP2血清可以識(shí)別雄性配子體，表明PvHAP2的免疫血清可以識(shí)別瘧原蟲(chóng)天然抗原(圖4)。

圖4 間接免疫熒光檢測(cè)PvHAP2在間日瘧原蟲(chóng)配子體中的表達(dá)Fig.4 Indirect immunofluorescence for PvHAP2 expression in Plasmodium vivax gametocyteBF: 明視野; DAPI: 間日瘧原蟲(chóng)細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色；FITC: 熒光顯微鏡綠色熒光視野；Merge: DAPI和FITC的合成圖; Control: 免疫前血清分離的IgG(陰性對(duì)照).標(biāo)尺為5 μm.BF: Bright field; DAPI: Nucleus stained with DAPI; FITC: gGreen fluorescence; Merge: DAPI+FITC. Control: IgG isolated from pre-immune serum was used as negative control. The scale is 5 μm.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)評(píng)估傳播阻斷活性

為了評(píng)估抗PvHAP2的抗體是否可以阻斷間日瘧原蟲(chóng)向按蚊的傳播。將純化的IgG跟志愿者AB+血清混合后再與間日瘧原蟲(chóng)患者血液混合，進(jìn)行膜飼實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抗PvHAP2抗體表現(xiàn)出了TRA效應(yīng)。與對(duì)照血清相比，抗PvHAP2的感染率降低25%，同時(shí)，抗PvHAP2抗體導(dǎo)致平均卵囊數(shù)降低15.3%(圖5, 表1)。

圖5 抗PvHAP2 IgG的傳播阻斷效應(yīng)的評(píng)估Fig.5 The transmission blocking effects of purified anti-PvHAP2 IgG

表1 抗PvHAP2 IgG的傳播阻斷效應(yīng)Tab.1 The transmission blocking effect of anti-PvHAP2 IgG

3 討論

傳播阻斷疫苗以瘧原蟲(chóng)有性階段表面表達(dá)的分子為靶點(diǎn)，通過(guò)抑制其在按蚊宿主體內(nèi)發(fā)育進(jìn)而阻止其傳播。目前，傳播阻斷疫苗(TBV)候選抗原主要集中配子和動(dòng)合子等階段的表面抗原，而對(duì)配子期表面抗原的研究較少。盡管配子表面抗原暴露于宿主抗體的時(shí)間相對(duì)較短(一般少于1 h)，但配子產(chǎn)生的抗體卻具有很強(qiáng)的TRA(Munesingheetal.，1986)活性。參與受精過(guò)程的配子體蛋白(例如P230和P48/45)是表達(dá)在配子表面的具有成為TBV候選抗原潛能的分子靶點(diǎn)。P25和P28是動(dòng)合子上的主要候選抗原，異源表達(dá)的P25和P28在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可以抑制瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育(Kaslowetal.，1994, Hisaedaetal.，2000)。然而，在最近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)即使和EPA進(jìn)行偶聯(lián)，針對(duì)Pfs25產(chǎn)生的抗體的存在周期依然比較短，并且只有通過(guò)4次免疫后的標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)才有傳播阻斷活性，而直接通過(guò)皮膚叮咬則不可以(Sagaraetal.，2018)。目前，間日瘧原蟲(chóng)的TBV研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于惡性瘧原蟲(chóng)，這主要是由于缺乏間日瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，大多數(shù)SMFA都是用野外分離株進(jìn)行的。迄今為止，僅對(duì)間日瘧原蟲(chóng)中的少數(shù)TBV候選基因進(jìn)行了研究，并且?guī)缀跛写祟愌芯烤趷盒辕懺x(chóng)同源蛋白的研究，而兩者的生物學(xué)特性依然有很大差異。間日瘧原蟲(chóng)的TBV研究集中在Pvs25和Pvs28。在這里，我們的結(jié)果表明，PvHAP2表達(dá)在雄性配子體上，同時(shí)抗血清具有一定的傳播阻斷活性，可以作為間日瘧原蟲(chóng)TBV的候選抗原。

HAP2是一種在雄性配子中表達(dá)的雄性特異性分子。HAP2具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域II和III參與介導(dǎo)配子膜融合。在結(jié)構(gòu)域II中的有一段～40 aa短肽為融合環(huán)(cd環(huán))(Fédryetal., 2017)。研究表明，針對(duì)在大腸桿菌中表達(dá)的重組PbHAP2蛋白(aa 355-609)產(chǎn)生的多克隆抗血清能夠在體外有效抑制伯氏瘧原蟲(chóng)向動(dòng)合子轉(zhuǎn)化，并在體內(nèi)抑制卵囊的發(fā)育(Blagboroughetal.，2009)。針對(duì)在小麥胚芽無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白PfHAP2(對(duì)應(yīng)于PbHAP2片段)產(chǎn)生的多克隆抗血清在SMFA中也顯示出高TRA水平(Miuraetal.，2013)。最近，在PbHAP2和PfHAP2的結(jié)構(gòu)域II中鑒定出cd融合環(huán)，并且針對(duì)與載體蛋白耦連后的cd環(huán)的抗體在體外顯示出對(duì)動(dòng)合子轉(zhuǎn)化和按蚊傳播的有效抑制(Angrisanoetal.，2017)。 HAP2是II類融合蛋白，雌雄配子識(shí)別結(jié)合的過(guò)程，因此抗HAP2抗血清抑制動(dòng)合子形成可能是通過(guò)影響受精過(guò)程中膜融合導(dǎo)致的。針對(duì)HAP2的抗體也可能通過(guò)形成空間障礙而阻止雌、雄配子相互作用。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了間日瘧原蟲(chóng)aa 231-459 之間的蛋白。用鎳柱純化重組蛋白后免疫小鼠并純化得到IgG。IFA研究發(fā)現(xiàn)，抗PvHAP2抗體可以有效的識(shí)別間日瘧的雄性配子體。同時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有TRA效應(yīng)，但是阻斷效果不如前期已發(fā)表的桿狀病毒表達(dá)蛋白免疫得到的抗體明顯。本研究中，抗原核表達(dá)蛋白PvHAP2抗體使按蚊感染率降低了25%，平均卵囊數(shù)降低了15.3%。抗桿狀病毒表達(dá)蛋白獲得的PvHAP2抗體使按蚊感染率降低了50%，平均卵囊數(shù)降低了59.07%。我們推測(cè)可能原因是由于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白未能折疊出完全有效的空間結(jié)構(gòu)，蛋白表達(dá)后修飾不足所導(dǎo)致。瘧原蟲(chóng)基因組特征是阻礙瘧原蟲(chóng)蛋白表達(dá)的主要原因，包括：(1)瘧原蟲(chóng)基因組中腺嘌呤和胸腺嘧啶的含量比較高；(2)瘧原蟲(chóng)具有獨(dú)特的翻譯后修飾。雖然間日瘧原蟲(chóng)基因組在許多方面與惡性瘧原蟲(chóng)相似，但間日瘧原蟲(chóng)在端?！h(yuǎn)端區(qū)域富含GC，這些原因?qū)е麓竽c桿菌轉(zhuǎn)錄效率低下，使得瘧原蟲(chóng)蛋白在非天然宿主中的異源表達(dá)存在蛋白折疊錯(cuò)誤的可能性。

本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)PvHAP2片段包含aa 231-459兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，但是不包括cd環(huán)區(qū)域。通過(guò)對(duì)不同區(qū)域表達(dá)的蛋白進(jìn)行研究，可以篩選出更有優(yōu)勢(shì)的候選抗原表位。在本實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)rPvHAP2具有較好的免疫原性，能夠有效識(shí)別出間日瘧原蟲(chóng)的雄性配子體。但受制于低效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，所得到的抗體傳播阻斷效果不佳。