艾連中，范藝周，熊智強(qiáng)

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心 上海200093）

為適應(yīng)復(fù)雜的外界環(huán)境，感知細(xì)胞外信號(hào)并將其傳遞，對(duì)細(xì)菌生存尤為重要。信使分子環(huán)二鳥(niǎo)苷酸 【Bis-（3'-5'） cyclic di-guanylate acid，cdi-GMP】和環(huán)二腺苷酸（Cyclic dimeric adenosine 3'-5'-monophosphote，c-di-AMP）在信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用（圖1）。c-di-GMP 廣泛介導(dǎo)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期進(jìn)程和胞外多糖合成等多種生理功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-2]。c-di-GMP 代謝過(guò)程涉及2 種關(guān)鍵酶——二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（Diguanosine cyclase，DGC） 和磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE），2 分子GTP 在DGC 催化下合成1分子c-di-GMP，而c-di-GMP 能被PDE 水解為5'-pGpG【5'-phosphoadenylyl-（3'-5'）-guanosine】或GMP[3]。

c-di-AMP 是繼c-di-GMP 之后發(fā)現(xiàn)的新型第二信使分子，在細(xì)菌和古生菌中廣泛存在，尤其在厚壁菌門(mén)中。c-di-AMP 首次在海棲熱袍菌DisA 蛋白 （DNA integrity scanning protein A）晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)[4]。二腺苷酸環(huán)化酶（Diadenylate cyclase，DAC） 能夠以2 分子ATP 或ADP 為底物合成1 分子c-di-AMP，而c-di-AMP 在磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）催化下水解為5'-pApA【5'-phosphoadenylyl-（3'-5'）-adenosine】，少數(shù)情況下水解為AMP。隨著c-di-AMP 受體蛋白及保守結(jié)構(gòu)域被鑒定，使c-di-AMP 介導(dǎo)細(xì)菌生理功能的分子機(jī)制逐漸清晰，c-di-AMP 可調(diào)控脂肪酸代謝、鉀離子穩(wěn)態(tài)、滲透壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒力和生物膜形成等生理功能[5-7]。

圖1 c-di-GMP 和c-di-AMP 的分子式Fig.1 The molecule formulas of c-di-GMP and c-di-AMP

1 第二信使分子代謝

1.1 c-di-GMP 代謝

細(xì)菌中第二信使分子介導(dǎo)的信號(hào)通路主要包括3 個(gè)環(huán)節(jié)：1）合成酶和分解酶；2）受體靶標(biāo)；3）受體靶標(biāo)調(diào)控的下游基因（表1）。在DGC 和PDE共同作用下細(xì)胞內(nèi)的c-di-GMP 嚴(yán)格控制在穩(wěn)定水平。在DGC 催化合成過(guò)程中，不僅能夠保證細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP 的濃度，還能避免過(guò)度消耗GTP。DGCs 通常含有2 個(gè)c-di-GMP 結(jié)合位點(diǎn)：A 位點(diǎn)和I 位點(diǎn)，A 位點(diǎn)即GGDEF 結(jié)構(gòu)域的GGDEF 基序，是催化合成的活性位點(diǎn)，而I 位點(diǎn)即RXXD 基序，與c-di-GMP 結(jié)合使兩位點(diǎn)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)并抑制c-di-GMP 合成，這種反饋調(diào)節(jié)保證細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP 的代謝處于動(dòng)態(tài)平衡。對(duì)于不具備I 位點(diǎn)的DGCs，只能在DGCs 與PDEs 的共同作用下才能維持代謝平衡。PDEs 含有EAL 結(jié)構(gòu)域或HDGYP 結(jié)構(gòu)域。EAL 結(jié)構(gòu)域被二價(jià)金屬離子Mg2+或Mn2+激活后可以水解c-di-GMP 為GMP，而Zn2+和Ca2+則抑制其水解活性。HD-GYP 結(jié)構(gòu)域的水解產(chǎn)物為5'-pGpG。DGC 和PDE 能夠通過(guò)特定結(jié)構(gòu)域感知抗生素、磷酸化反應(yīng)、金屬離子、光和小分子等外界刺激，觸發(fā)c-di-GMP 介導(dǎo)的信號(hào)通路，如PAS 結(jié)構(gòu)域能夠感知金屬離子變化，REC 結(jié)構(gòu)域感知磷酸化反應(yīng)和GAF 結(jié)構(gòu)域感知光信號(hào)。

表1 c-di-GMP 和c-di-AMP 介導(dǎo)的信號(hào)通路Table 1 c-di-GMP and c-di-AMP mediated signaling pathways

1.2 c-di-AMP 代謝

在細(xì)菌中c-di-AMP 以級(jí)聯(lián)方式進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，目前具有DAC 活性的蛋白主要有DisA、CdaA（也稱DacA 或YbbP）、CdaS （也稱YojJ） 和CdaM[14，21]，其催化活性在保守DAC 或DisA_N 結(jié)構(gòu)域。DisA 以八聚體形式存在，其C 端DNA 結(jié)合基序HhH 有助于四聚化，而N 端DAC 結(jié)構(gòu)域有助于二聚化[5，18，22]。CdaA 除保守DGA 和RHR 基序，還含有3 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和2 個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。單增李斯特菌中截短的CdaA （不含跨膜結(jié)構(gòu)域）以二聚體形式存在，其活性受調(diào)控蛋白CdaR 影響。CdaS 與CdaA 氨基酸序列同源性約40%，CdaS 以六聚體形式存在于芽孢桿菌屬和梭菌屬[23]。DisA、CdaA 和CdaS 均為嚴(yán)格的二價(jià)金屬離子依賴型催化酶，在堿性條件下酶活最高。

已報(bào)道的PDE 蛋白主要有GdpP（GGDEF domain protein-containing phosphodiesterase）、PgpH 和Pde2，其催化活性在保守的DHH/DHHA1或HD 結(jié)構(gòu)域[24]。最先發(fā)現(xiàn)的PDE 蛋白是GdpP，該蛋白包含1 個(gè)退化的GGDEF 結(jié)構(gòu)域，1 個(gè)PAS感覺(jué)結(jié)構(gòu)域，1 個(gè)DHH/DHHA1 結(jié)構(gòu)域和2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。Cho 等[25]發(fā)現(xiàn)化膿鏈球菌GdpP 跨膜區(qū)的空間結(jié)構(gòu)對(duì)其催化活性至關(guān)重要[26]。Pde2 是僅含有DHH/DHHA1 結(jié)構(gòu)域的PDE，與GdpP 不同的是，Pde2 不僅水解c-di-AMP 為5'-pApA，而且能進(jìn)一步水解5'-pApA 為AMP[27-28]。含HD 結(jié)構(gòu)域的PgpH 也具有PDE 活性，可水解c-di-AMP 為5'-pApA，其催化活性受另一種核苷酸信號(hào)分子ppGpp 的抑制。PDE 水解活性也需要二價(jià)金屬離子才能在堿性條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的酶活性[29]。目前c-di-AMP 代謝蛋白中僅報(bào)道GdpP 含PAS 感知結(jié)構(gòu)域，而嗜熱鏈球菌S-3 的GdpP 蛋白不含PAS 結(jié)構(gòu)域[30]。Zeden 等[31]研究表明谷氨酰胺和銨鹽可調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌c-di-AMP 代謝蛋白活性，影響胞內(nèi)c-di-AMP 水平。進(jìn)一步分析gdpP和ybbR 突變體中谷氨酰胺和銨鹽濃度改變對(duì)cdi-AMP 水平的影響，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺和銨鹽并非通過(guò)PDE 和DAC 調(diào)節(jié)YbbR 蛋白而影響c-di-AMP濃度。雖然作者未確定谷氨酰胺和銨鹽作用的具體靶標(biāo)，但是這仍表明細(xì)菌內(nèi)氨基酸或小分子會(huì)影響胞內(nèi)c-di-AMP 濃度。鑒于此，對(duì)不含感知結(jié)構(gòu)域的c-di-AMP 代謝蛋白，其信號(hào)感知是一個(gè)重要的研究方向。

2 第二信使分子受體靶標(biāo)

精確控制細(xì)菌具體生理過(guò)程需深入研究信使分子與受體靶標(biāo)的相互作用。目前第二信使分子的受體靶標(biāo)主要有：1） 含有特定結(jié)構(gòu)域或位點(diǎn)的蛋白；2）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；3）核糖開(kāi)關(guān)（圖2）。c-di-GMP 受體靶標(biāo)較為透徹，退化的GGDEF 結(jié)構(gòu)域和EAL 結(jié)構(gòu)域雖喪失催化活性，但能結(jié)合c-di-GMP 介導(dǎo)細(xì)胞膜形成和細(xì)菌毒力等生理過(guò)程[8]。c-di-GMP 特異性結(jié)合PilZ 結(jié)構(gòu)域，使該結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，這是一種相對(duì)簡(jiǎn)單且廣泛存在的調(diào)節(jié)方式[32-33]。c-di-GMP 還可通過(guò)受體蛋白及其相鄰蛋白結(jié)構(gòu)或活性的變化調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。銅綠假單胞菌中相鄰蛋白Alg8 和Alg44 催化海藻酸鈉聚合，當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP 處于較低水平時(shí)，Alg44抑制Alg8 活性，而胞內(nèi)c-di-GMP 濃度升高，cdi-GMP 與Alg44 的PilZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可解除抑制并調(diào)節(jié)下游分子。鮑曼不動(dòng)桿菌中，c-di-GMP 結(jié)合位點(diǎn)為PgaC 和PgaD 蛋白的界面口袋。在不存在c-di-GMP 的情況下，PgaD 會(huì)迅速降解并關(guān)閉胞外多糖的合成。c-di-GMP 不僅能特異性結(jié)合相應(yīng)的受體蛋白，改變酶活性或酶結(jié)構(gòu)介導(dǎo)多種信號(hào)通路，還能通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子引起下游基因表達(dá)改變。大腸桿菌1094 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CsgD和銅綠假單胞菌FleQ 與c-di-GMP 結(jié)合分別促進(jìn)和抑制相關(guān)基因的表達(dá)[1，3]。c-di-GMP 受體靶標(biāo)其保守的結(jié)構(gòu)域或結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)單一，目前僅有PilZ 結(jié)構(gòu)域和I 位點(diǎn)等少數(shù)結(jié)構(gòu)域可特異性結(jié)合c-di-GMP，而特異性結(jié)合c-di-AMP 結(jié)構(gòu)域包括USP[9]、DUF970[10]、CBS[34]、TrkA_N 和TrkA_C[6]及RCK_N 和RCK_C 等[11，35]（表1）。盡管c-di-AMP受體蛋白保守結(jié)構(gòu)域具有多樣性，其響應(yīng)方式還相對(duì)單一且不同于c-di-GMP。

3 第二信使分子調(diào)控細(xì)菌胞外多糖生物合成

細(xì)菌胞外多糖是代謝過(guò)程中分泌到胞外的一類高分子聚合物，因其獨(dú)特的流變學(xué)特性、物理學(xué)特性、良好生物相容性而在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[36]。細(xì)菌胞外多糖生物合成受eps 基因簇控制，通常包含調(diào)控基因、鏈長(zhǎng)決定基因、重復(fù)單元合成基因及多糖聚合和輸出基因[37]。

3.1 c-di-GMP 調(diào)控細(xì)菌胞外多糖生物合成

c-di-GMP 介導(dǎo)纖維素、Pel 多糖、Psl 多糖、海藻酸鈉、聚乙酰葡萄糖胺和凝膠多糖等細(xì)菌胞外多糖生物合成。例如，銅綠假單胞菌中c-di-GMP通過(guò)含PilZ 結(jié)構(gòu)域的Alg44 蛋白及其相鄰蛋白Alg8 的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)海藻酸鈉生物合成，通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FleQ 與pel 操縱子和psl 操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控Pel 多糖和Psl 多糖的生物合成[1，3]。銅綠假單胞菌基因組中編碼膜蛋白MucR、RoeA、SadC、BifA 和SiaD 及非膜蛋白WspR和DgcP 等多種c-di-GMP 代謝蛋白，這些c-di-GMP 合成酶和分解酶部分用于調(diào)節(jié)胞內(nèi)c-di-GMP 整體水平，部分僅改變c-di-GMP 局部濃度并通過(guò)周圍分子影響細(xì)胞代謝或其它生理生化過(guò)程。Nicastro 等[38]研究表明在fimV（編碼T4 型菌毛組裝蛋白）突變體中過(guò)表達(dá)dgcP（編碼c-di-GMP合成酶）導(dǎo)致生物膜形成嚴(yán)重受損。過(guò)表達(dá)wspR（編碼另一種c-di-GMP 合成酶） 能夠彌補(bǔ)dgcP突變?cè)斐傻腸-di-GMP 水平降低，且在dgcP 與fimV 突變體中過(guò)表達(dá)wspR，使胞外多糖合成與生物膜形成與野生型相比沒(méi)有顯著差異，表明DgcP是c-di-GMP 水平的局部調(diào)節(jié)劑。鑒于c-di-GMP在銅綠假單胞菌胞外多糖生物合成中的重要作用，可通過(guò)操縱胞內(nèi)c-di-GMP 水平或改造受體蛋白同源物來(lái)提高胞外多糖合成。此外，Nicastro等[38]還發(fā)現(xiàn)LB 培養(yǎng)基和TSB 培養(yǎng)基中dgcP 突變體生物膜形成受損，而在M63 與M8 培養(yǎng)基中dgcP 突變對(duì)生物膜形成無(wú)顯著影響。由于胞外多糖作為生物膜基質(zhì)的主要組成部分，作者推測(cè)cdi-GMP 對(duì)胞外多糖調(diào)節(jié)與培養(yǎng)基存在關(guān)聯(lián)，因此，同時(shí)控制胞內(nèi)c-di-GMP 水平和培養(yǎng)基有望實(shí)現(xiàn)細(xì)菌胞外多糖的高效合成[39]。

圖2 c-di-GMP 和c-di-AMP 介導(dǎo)的細(xì)菌信號(hào)通路Fig.2 The bacterial signaling pathway mediated by c-di-GMP and c-di-AMP

分析c-di-GMP 受體蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP 調(diào)控細(xì)菌胞外多糖的信號(hào)通路還涉及相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶。木醋桿菌中AscA 蛋白含有PilZ和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，c-di-GMP 與AscA 結(jié)合控制纖維素生物合成。銅綠假單胞菌中c-di-GMP通過(guò)受體蛋白Alg44 及其相鄰蛋白Alg8 共同發(fā)揮調(diào)控海藻酸鈉生物合成，而Alg8 含糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。根癌農(nóng)桿菌胞內(nèi)c-di-GMP 濃度提高刺激含PilZ 結(jié)構(gòu)域的CelA 糖基轉(zhuǎn)移酶亞基活性，進(jìn)而提高纖維素的合成與分泌。此外，鮑曼不動(dòng)桿菌PgaC 和鼠疫耶爾森氏菌HmsR 兩種c-di-GMP 受體蛋白也含有糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[3]。雖然不是所有細(xì)菌都通過(guò)c-di-GMP 與糖基轉(zhuǎn)移酶相互作用來(lái)調(diào)控胞外多糖的合成與分泌，但是上述這些研究為尋找調(diào)控胞外多糖的受體蛋白及其保守結(jié)構(gòu)域或基序提供指導(dǎo)。

3.2 c-di-AMP 調(diào)控細(xì)菌胞外多糖生物合成

c-di-AMP 調(diào)控細(xì)菌胞外多糖的研究起步較晚，目前僅在變形鏈球菌和枯草芽孢桿菌生物膜研究中發(fā)現(xiàn)c-di-AMP 參與胞外多糖的合成與分泌[6，39]。在枯草芽孢桿菌中c-di-AMP 通過(guò)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SinR 及其運(yùn)動(dòng)蛋白SlrR 相互作用來(lái)控制聚-N-乙酰氨基葡萄糖 （PNAG） 的生物合成。PNAG 合成主要由epsA-O 基因簇控制，負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SinR 可與epsA-O 操縱子啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合抑制基因表達(dá)，而c-di-AMP 與SinR 結(jié)合可以解除這種抑制，促進(jìn)PNAG 的合成；SinR 的DNA結(jié)合活性受SlrR 影響，SlrR 與SinR 的結(jié)合也可緩解這種抑制。由于SlrR 限制運(yùn)動(dòng)性和自溶素基因的表達(dá)，當(dāng)枯草芽孢桿菌中c-di-AMP 濃度升高或降低時(shí)，SinR 與epsA-O 操縱子或SlrR 的相互作用，使得細(xì)胞可以在浮游狀態(tài)和生物粘附狀態(tài)之間自由切換[36-37]。c-di-AMP 與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SinR 相互作用研究豐富了c-di-AMP 介導(dǎo)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，在分子水平調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PNAG 合成。

變形鏈球菌能通過(guò)GtfB，GtfC 和GtfD 3 種葡糖基轉(zhuǎn)移酶將蔗糖轉(zhuǎn)化為水溶性或水不溶性葡聚糖，該過(guò)程受c-di-AMP 控制[40]。變形鏈球菌中cdi-AMP 的代謝相對(duì)簡(jiǎn)單，只含1 種DAC 蛋白CdaA 和1 種PDE 蛋白PdeA。Cheng 等[41]發(fā)現(xiàn)在cdaA 突變體中200 個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，且大多數(shù)基因與細(xì)菌胞外多糖合成和氧化還原相關(guān)，推測(cè)c-di-AMP 濃度降低導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量升高，是為了避免氧化應(yīng)激損傷。然而，Peng等[6]獲得了完全不同的試驗(yàn)結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP 水平下降抑制胞外多糖合成，而不是促進(jìn)胞外多糖合成[42]。受體蛋白CabpA 通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域TrkA_C 與c-di-AMP 和蛋白VicR 相互作用調(diào)控葡聚糖合成。目前CabpA 和VicR 互作機(jī)制尚未明晰，其調(diào)節(jié)機(jī)制可能是c-di-AMP 與CabpA 結(jié)合，導(dǎo)致VicR 無(wú)法與CabpA 相互作用，使游離的VicR 與gtfB-D 操縱子結(jié)合并促進(jìn)gtfB 表達(dá)，造成葡聚糖合成顯著增加[43]。Cheng 等[41]的研究局限于基因突變或過(guò)表達(dá)引起的表型變化，而Peng 等[7]鑒定了c-di-AMP 受體蛋白，完善了cdi-AMP 介導(dǎo)的變形鏈球菌葡聚糖生物合成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，未解析c-di-AMP 介導(dǎo)的胞外多糖信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制。雖然c-di-AMP 在變形鏈球菌葡聚糖合成中的作用尚不明確，但可以確定c-di-AMP 參與胞外多糖合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

4 結(jié)論

c-di-GMP 和c-di-AMP 是細(xì)菌中廣泛存在的第二信使分子，在細(xì)胞代謝和生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)c-di-GMP 和c-di-AMP 介導(dǎo)細(xì)菌胞外多糖生物合成的信號(hào)機(jī)制逐漸清晰，尤其是c-di-GMP 調(diào)控。目前c-di-GMP代謝蛋白及受體靶標(biāo)的研究較為成熟，而c-di-GMP 新受體靶標(biāo)鑒定、c-di-GMP 多種代謝蛋白的不同調(diào)節(jié)模式及c-di-GMP 與其它信號(hào)系統(tǒng)的互作都是未來(lái)的研究熱點(diǎn)。有關(guān)c-di-AMP 對(duì)細(xì)菌胞外多糖合成調(diào)控的研究起步較晚，其信號(hào)機(jī)制還有待完善，目前僅在枯草芽孢桿菌與變形鏈球菌中有初步研究。對(duì)于高產(chǎn)胞外多糖而不編碼合成c-di-GMP 的優(yōu)良菌株，c-di-AMP 對(duì)其胞外多糖的合成調(diào)控仍是未來(lái)的研究重點(diǎn)。對(duì)c-di-GMP 和c-di-AMP 調(diào)控的細(xì)菌信號(hào)機(jī)制的分析表明，c-di-GMP 受體靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)雖具有保守性，但響應(yīng)方式多樣，而c-di-AMP 與受體靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)雖多樣，但結(jié)合方式保守，因此鑒定新的c-di-GMP/c-di-AMP 受體蛋白對(duì)于全面揭示第二信使分子的信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。第二信使分子可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯后水平對(duì)細(xì)菌多種代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，已成為一類高度保守的分子控制機(jī)制，這也為全面揭示c-di-GMP 和c-di-AMP對(duì)細(xì)菌胞外多糖的合成調(diào)控奠定基礎(chǔ)。