李秋瑩，徐瑾秀，朱金帥，林 洪，孫 彤，勵建榮*

（1 渤海大學食品科學與工程學院 遼寧錦州121013 2 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 3 中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島266100）

水產(chǎn)品口感鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛，然而，水產(chǎn)品極易腐敗變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失。由于微生物的生長和入侵是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要因素[1]，因此水產(chǎn)品的保鮮過程中對微生物的抑制十分重要。低溫保鮮技術(shù)是使用最早，也是應(yīng)用最廣的水產(chǎn)品保鮮技術(shù)[2]。低溫會使微生物的生理機能發(fā)生重要的變化，比如膜流動性降低，核酸二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強，轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白折疊的效率降低等[3]。在低溫下有些微生物仍能以一定的生長速率生長，即使生長較慢。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一種耐冷菌，在0 ℃下也能生長、繁殖，其在有氧冷凍或冷藏狀態(tài)下是多種水產(chǎn)品的特定腐敗菌[4]，引起冷藏水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，這嚴重降低了水產(chǎn)品的品質(zhì)，極有可能導(dǎo)致食品安全問題。鑒于水產(chǎn)品保鮮的重要經(jīng)濟價值，深入了解腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)的分子機制，可以輔助預(yù)測腐敗菌在冷藏食品中的行為，便于進行更準確的風險預(yù)測和防范。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物在低溫作用下會產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)，生成一系列的抗低溫蛋白，稱為冷激蛋白（Cold shock protein，CSPs）[5]。細菌冷激蛋白是一類包含核酸結(jié)合冷休克結(jié)構(gòu)域的高度保守的小分子蛋白（～7.4 ku），可以作為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA 結(jié)合，阻止DNA 或RNA 在低溫下形成二級結(jié)構(gòu)，從而促進轉(zhuǎn)錄和翻譯[6]。此外，冷激蛋白還參與細菌的多個生理生化過程，如：細胞膜的流動性，細菌正常生長與分化，營養(yǎng)脅迫，細菌的毒力等。冷激蛋白對細菌在低溫時恢復(fù)生長和發(fā)揮細胞各種功能是非常重要的[7-9]，是解析微生物低溫適應(yīng)機制的關(guān)鍵蛋白。然而，目前關(guān)于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的研究鮮有報道。

細菌通常具有多個冷激蛋白，且冷激蛋白的作用規(guī)律十分復(fù)雜，并非所有冷激蛋白都受低溫誘導(dǎo)表達[10]。通過對NCBI（National center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫中腐敗希瓦氏菌模式菌株的全基因組序列檢索，發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌中存在3 個典型冷激蛋白，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其主要冷激蛋白及相關(guān)功能的研究。本文以水產(chǎn)品的腐敗希瓦氏菌為研究對象，通過PCR 擴增獲得水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白基因序列，在此基礎(chǔ)上通過生物信息學分析腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特性等，旨在為冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過程中的功能研究，以及對水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌的抑制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌為本實驗室自腐敗的冷藏大菱鲆中分離所得，于-80 ℃保藏。聚合酶鏈式反應(yīng)（Polemerase chain reaction，PCR）引物委托生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司合成。EasyTaqRDNA Polymerase，北京全是金生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、GeneRed 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest 瓊脂糖、LB 營養(yǎng)瓊脂、LB 營養(yǎng)肉湯，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

防蒸發(fā)梯度PCR，美國Eppendrof 公司；凝膠電泳及配套設(shè)備，美國Bio-Bad 公司；微量冷凍離心機，美國Thermo 公司。

1.3 菌種鑒定及冷激蛋白基因的克隆與測序

活化本實驗室保藏的腐敗希瓦氏菌，按照基因組DNA 提取試劑盒的操作步驟提取基因組DNA，利用細菌16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R 進行PCR 擴增，獲得腐敗希瓦氏菌的16S rRNA 基因（表1）[11]。采用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢索近緣腐敗希瓦氏菌菌株基因組信息（GenBank：CP002457.1），依據(jù)注釋冷激蛋白基因及其上、下游序列，設(shè)計引物（表1），進行冷激蛋白的Csp1589，Csp1376 和Csp2252 基因的擴增。PCR 擴增條件為94 ℃5 min；94 ℃30 s，Tm℃30 s（詳見表1），72 ℃45 s，循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工測序。

表1 菌種鑒定及冷激蛋白基因擴增的引物Table 1 Primers of strain identification and cold shock protein gene amplification

1.4 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

自NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得大腸桿菌（NC_000913.3）的9 個冷激蛋白（CspA～I），以FASTA file 形式保存。通過軟件Clustal X 對測序所得腐敗希瓦氏菌冷激蛋白和大腸桿菌的冷激蛋白進行序列比對，并用Mega7.0 中的鄰接法 （Neighbor-jioning method，NJ）為其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，步長值（Bootstrap values）為1 000[12]。

1.5 冷激蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

用ExPASy 網(wǎng)站中的一個工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）來預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，用PSORT www Server 中的PSORT Prediction 工具預(yù)測冷激蛋白細胞定位，用TMHMM Server 2.0 預(yù)測冷激蛋白跨膜區(qū)域，用SignalIP 5.0 在線預(yù)測冷激蛋白信號肽，用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測冷激蛋白結(jié)構(gòu)域的構(gòu)成及其功能，用在線軟件NCBI Conserved Domain Search 進行其氨基酸保守序列分析。

1.6 結(jié)構(gòu)預(yù)測與模型質(zhì)量評估

使 用PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/） 預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)。將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）網(wǎng)站進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測[13]。將構(gòu)建的蛋白三級模型用PROCHECK 和Verify3D 進行質(zhì)量評估[14-16]。PROCHECK 和Verify3D 是SAVES v5.0（http：//servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）中的結(jié)構(gòu)評估服務(wù)。

1.7 互作蛋白及配體結(jié)合位點的預(yù)測

用STRING（https：//string-db.org/）工具確定在活體內(nèi)與腐敗希瓦氏菌冷激蛋白存在相互作用的蛋白。這種相互作用既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性[17]。將從SWISS-MODEL 得到的模型文件輸入COACH （https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COACH/），以預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白潛在的配體結(jié)合位點[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷激蛋白基因的克隆

通過16S 測序結(jié)果的比對分析確定該菌為腐敗希瓦氏菌。以這株水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的基因組DNA 為模板，用相應(yīng)引物對冷激蛋白基因進行PCR 擴增，然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物[19]，結(jié)果如圖1所示。PCR 擴增產(chǎn)物的長度在500 bp 左右，與預(yù)期的產(chǎn)物大小相符。將PCR 產(chǎn)物送至上海生工測序，并將測序序列用ORF Finder 軟件和Blast 分析。使用ORF Finder軟件的結(jié)果表明，克隆的基因片段都有完整的開放閱讀框 （ORF），3 個冷激蛋白基因Csp1589，Csp1376 和Csp2252 的ORF 長度分別為210，210，207 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，分別編碼69，69，68 個氨基酸。Blast 結(jié)果表明，水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白基因與腐敗希瓦氏菌模式菌株的3 個冷激蛋白基因的序列相似性均達100%，說明冷激蛋白高度保守。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的冷激蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果如圖2所示。水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp1589 和Csp1376 與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspA 聚類在同一類群，表明它們之間的有較高的相似性和較近的親緣關(guān)系。大腸桿菌CspA 為主要的冷誘導(dǎo)蛋白，低溫下大量表達[7，20-21]。初步推測Csp1589 和Csp1376 在腐敗希瓦氏菌對低溫脅迫的適應(yīng)中起關(guān)鍵作用。腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252 與大腸桿菌的冷激蛋白基因CspD位于同一分枝，大腸桿菌CspD 在營養(yǎng)缺乏時大量表達并能結(jié)合單鏈DNA，從而抑制染色體的復(fù)制[22]，因此腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白基因Csp2252可能與細胞生長分化有關(guān)。

2.3 冷激蛋白的理化特點

圖1 冷激蛋白基因PCR 擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification products of CSPs genes

圖2 冷激蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the CSPs

利用ProtParam 預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，結(jié)果見表2。預(yù)測的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白是由68～69 個氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量在7.4 ku 左右的小分子蛋白，且其帶負電荷的氨基酸的量大于帶正電荷氨基酸的量，即酸性氨基酸的量大于堿性氨基酸的量，PI 小于7，說明這些蛋白質(zhì)都是酸性蛋白質(zhì)，符合CSPs 的特點[23-24]。蛋白質(zhì)的總平均親水性為負數(shù)，說明測定的蛋白皆為親水性蛋白[25]。由不穩(wěn)定系數(shù)可知，除Csp2252 外，蛋白質(zhì)在體外的穩(wěn)定性都較好，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。PSORT 預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白皆定位于細胞質(zhì)。TMHMM預(yù)測結(jié)果顯示腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均不存在α螺旋跨膜，是非跨膜蛋白。SignalIP 預(yù)測結(jié)果表明腐敗希瓦氏菌冷激蛋白不存在信號肽，不能分泌到胞外。推測腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白均為非分泌型、非跨膜蛋白，冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌細胞質(zhì)中合成后不進行蛋白轉(zhuǎn)運，而是保留在細胞基質(zhì)中發(fā)揮作用。

表2 冷激蛋白的理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of the psysicochemical property of the CSPs

2.4 冷激蛋白的氨基酸保守序列及結(jié)構(gòu)域分析

將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交至CD service，檢測結(jié)果顯示：腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589、Csp1376 和Csp2252 都具有DNA 結(jié)合位點和RNA 結(jié)合基序，且同屬于類S1總科。類S1 總科是一類包含與核糖體蛋白S1 的RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域的蛋白合集[26]。這種結(jié)構(gòu)最初在S1 核糖體蛋白中被發(fā)現(xiàn)，目前已在多種RNA 相關(guān)蛋白中被發(fā)現(xiàn)。SMART 預(yù)測結(jié)果表明：腐敗希瓦氏菌的3 個冷激蛋白都包含冷休克結(jié)構(gòu)域（Cold shock domain，CSD），冷休克結(jié)構(gòu)域?qū)儆陬怱1 總科這個超級家族，且其從原核生物到高等真核生物高度保守，具有RNA 分子伴侶功能[27-28]。包含冷休克結(jié)構(gòu)域的蛋白可以參與多種細胞生理生化過程，包括對低溫的適應(yīng)、營養(yǎng)脅迫、細胞生長和發(fā)育過程等[29]。此外，由圖3可知腐敗希瓦氏菌的冷激蛋白Csp1589 和Csp1376 屬于保守蛋白結(jié)構(gòu)域家族CspC，是冷誘導(dǎo)蛋白，因此推測Csp1589 和Csp1376 與細菌對低溫的適應(yīng)性有關(guān)；而腐敗希瓦氏菌Csp2252 不屬于CspC 家族，其可能參與其它的細胞過程，這個結(jié)果與上述系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果一致。

圖3 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸保守序列Fig.3 Amino acid conserved sequence of S.putrefaciens CSPs

2.5 冷激蛋白的結(jié)構(gòu)分析

為更好了解冷激蛋白潛在的生物功能，分析其蛋白的空間結(jié)構(gòu)。將水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到PSIPRED 預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。典型的冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含5 個β 折疊[24]，預(yù)測得到的二級結(jié)構(gòu)與這個結(jié)果大致相符，Csp1589 和Csp1376 二級結(jié)構(gòu)的最后一個β 折疊出現(xiàn)斷層，這可能是天冬酰胺預(yù)測可信度太低所致。

圖4 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of S.putrefaciens CSPs

圖5 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的三級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)評估Fig.5 Tertiary structure and structure assessment of S.putrefaciens CSPs

將冷激蛋白的氨基酸序列提交SWISS-MODEL 網(wǎng)站，根據(jù)序列相似性及模型質(zhì)量分別選取1mjc 的A 鏈、5xv9 的A 鏈、3i2z 的B 鏈作為Csp1589、Csp1376 和Csp2252 的模板建模。然后，用PROCHECK 和verify3D 對所建三級模型進行質(zhì)量評估。構(gòu)建的腐敗希瓦氏菌冷激蛋白三級結(jié)構(gòu)都包含5 個反向平行的β 鏈，其形成了一個桶狀結(jié)構(gòu)，符合冷激蛋白的已知特征[24]。由拉氏構(gòu)象圖可看出，對于Csp1589 蛋白模型，氨基酸處于有利區(qū)域、額外允許區(qū)域、一般允許區(qū)域以及不允許區(qū)域的量分別為88.9%，11.1%，0%和0%。對于Csp1376 型蛋白模型，對應(yīng)值分別為92.7%，7.3%，0.0%和0.0%。對于Csp2252 型蛋白模型，對應(yīng)值分別為96.1%，3.9%，0.0%和0.0%，氨基酸全部處于有利區(qū)域和額外允許區(qū)域，模型質(zhì)量較好。在Verify3D 結(jié)果中，對于Csp1589、Csp1376 和Csp2252 模型，平均分≥0.2 的氨基酸的量分別是和100%，89.86%和100%，平均分≥0.2 的氨基酸的量達到80%就認為蛋白三級模型是合格的，因此，以verify3D 結(jié)果來看，這3 個模型均具有較好的質(zhì)量。

2.6 冷激蛋白的互作蛋白及配體結(jié)合位點分析

利用STRING 和COACH 網(wǎng)站對腐敗希瓦氏菌冷激蛋白進行分析，得到如圖6所示與其緊密作用的蛋白質(zhì)和潛在的配體結(jié)合位點。對于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白 Csp1589、Csp1376 和Csp2252，STRING 分別檢測到5，4，10 個與其相互作用的蛋白（圖6）。與冷激蛋白Csp1589 存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、甲基轉(zhuǎn)移酶（ABP75296.1）、DNA 聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、伴侶蛋白（htpG）。與冷激蛋白Csp1376 存在相互作用的蛋白是組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA 聚合酶1（polA）、多功能融合蛋 白（trpC）、伴 侶 蛋 白（htpG）。與 冷 激 蛋 白Csp2252 存在相互作用的蛋白是依賴ATP 的Clp蛋白酶（ABP75948.1）、依賴ATP 的Clp 蛋白酶適配蛋白（ClpS）、組氨酸激酶（ABP76854.1）、DNA聚合酶1（polA）、多功能融合蛋白（trpC）、組氨酸-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶（hisC）、磷酸庚糖異構(gòu)酶（gmhA）、含有CBS 結(jié)構(gòu)域的蛋白（ABP76571.1）、氮調(diào)控蛋白PtsN（ABP74443.1）、伴侶蛋白（htpG）。其中組氨酸激酶是一個磷酸化組氨酸保守殘基的信號傳導(dǎo)酶家族，參與構(gòu)成雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)可以感應(yīng)環(huán)境變化，應(yīng)對環(huán)境變化引起的負面效應(yīng)[30]，研究表明一些雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了細菌的低溫適應(yīng)過程[10]，推測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白與細胞對逆境的適應(yīng)有關(guān)。DNA聚合酶是DNA 復(fù)制的重要酶，冷激蛋白可能與DNA 復(fù)制有關(guān)。冷激蛋白作為一種伴侶蛋白，可能與伴侶蛋白htpG 存在競爭關(guān)系。從分析結(jié)果可推測相較Csp1589 和Csp1376，腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp2252 的功能可能更為復(fù)雜。在許多重要的生命活動中，蛋白質(zhì)功能的執(zhí)行依賴于蛋白質(zhì)與配體的相互作用，對于蛋白質(zhì)配體結(jié)合位點的預(yù)測具有重要的意義[31]。例如：把小分子放到目的蛋白的配體結(jié)合位點，優(yōu)化配體構(gòu)象和位置，使之和目的蛋白有最佳的結(jié)合作用，就有可能發(fā)現(xiàn)抑制該蛋白的化合物。對于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589、Csp1376 和Csp2252，其分別預(yù)測到2，2，1 個可能性較高的配體結(jié)合位點（圖6）。

圖6 腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的互作蛋白及其潛在的配體結(jié)合位點Fig.6 Protein and protein interaction and potential ligand binding site of S.putrefaciens CSPs

3 結(jié)論

冷激蛋白是解析細菌低溫適應(yīng)的關(guān)鍵蛋白之一。本研究成功擴增了水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3個冷激蛋白基因，并對其進行生物信息學分析，獲得蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能方面的相關(guān)進展。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白均為親水的小分子酸性蛋白質(zhì)，皆位于細胞質(zhì)，為非分泌型、非跨膜蛋白，都存在冷激蛋白特有的冷休克結(jié)構(gòu)域，存在DNA 結(jié)合位點和RNA 結(jié)合基序（motif），能與單鏈DNA 和單鏈RNA 結(jié)合。腐敗希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589和Csp1376 與大腸桿菌冷激蛋白CspA 親緣關(guān)系較近，可能在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過程中起重要作用。冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均符合冷激蛋白家族的特征，其可靠的三級模型可用于各種對接和藥物靶向研究。通過蛋白互作和配體結(jié)合位點的分析，對其功能有更深的了解，為后續(xù)驗證冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過程中的功能，以及水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌冷激蛋白抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。