蘇英鈺，謝金生，程彬彬，徐永濤，胡曉龍，張微微*，王 丹，2

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院∕野生動(dòng)植物與自然保護(hù)地研究中心，江西南昌 330045；2.盤(pán)錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧盤(pán)錦 124000）

【研究意義】紅嘴相思鳥(niǎo)（Leiothrix lutea）是雀形目（Passeriformes）噪鹛科（Leiothrichidae）鳥(niǎo)類(lèi)[1]。廣泛分布于我國(guó)南方各省以及越南北部、緬甸西部和北部，并在日本、美國(guó)夏威夷群島以及歐洲中西部有穩(wěn)定的人工引入種群[2]。紅嘴相思鳥(niǎo)叫聲婉轉(zhuǎn)悅耳，顏色艷麗，是重要的觀賞鳥(niǎo)類(lèi)[3]。過(guò)去紅嘴相思鳥(niǎo)的貿(mào)易量很大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅1991－1995年4年時(shí)間合法出口量就在45萬(wàn)只以上，導(dǎo)致資源破壞嚴(yán)重[4]，因此被列入瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約（CITES）附錄Ⅱ，也被列入我國(guó)“三有”保護(hù)物種名錄[5]。其研究主要集中在消化系統(tǒng)[6-7]，神經(jīng)系統(tǒng)[8]，繁殖生態(tài)[9]、寄生蟲(chóng)[10-11]等方面，性比方面研究缺乏報(bào)道。性比（sex ratio）是指種群中雄性個(gè)體數(shù)目和雌性的數(shù)目的比例，通常也指雄性個(gè)體在群體中的比例[12]，是反映動(dòng)物種群狀況的基本特征參數(shù)之一，可分為初級(jí)性比（卵性比）和次級(jí)性比（雛鳥(niǎo)性比）以及成年性比（Adult Sex Ratio，ASR）。種群水平的成年性比對(duì)種群配偶關(guān)系及繁殖潛力有很大影響，它決定有效種群的大小，是種群走向繁榮還是沒(méi)落的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。因此，性比是動(dòng)物種群生態(tài)中的重要研究?jī)?nèi)容，特別是瀕危物種?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】了解鳥(niǎo)類(lèi)種群性比狀況，首先要鑒定鳥(niǎo)類(lèi)性別，其方法主要包括形態(tài)學(xué)方法、細(xì)胞生物學(xué)方法（染色體核型分析）和分子生物學(xué)方法，但形態(tài)學(xué)方法與細(xì)胞生物學(xué)方法對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的傷害性較大[14]，而分子生物學(xué)方法更安全可靠，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增法。Ellegren等[15]克隆了第一個(gè)定位在鳥(niǎo)類(lèi)W染色體的基因CHD1-W。由于CHD1基因的高度保守性，所以一對(duì)引物可以用于多種非平胸目鳥(niǎo)的性別鑒定；Griffiths等[16]設(shè)計(jì)了P2∕P8引物可用于絕大多數(shù)鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定，至今仍廣泛應(yīng)用于鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定和性比研究[17-19]。利用分子生物學(xué)手段對(duì)單態(tài)型鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行性別鑒定，具有準(zhǔn)確性高、簡(jiǎn)便、成本低且傷害較小等優(yōu)點(diǎn)[17]。【本研究切入點(diǎn)】紅嘴相思鳥(niǎo)屬單型性鳥(niǎo)類(lèi)，雌雄形態(tài)差異不顯著[20]，但市場(chǎng)上仍采用形態(tài)鑒定性別的方法。因此，本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)紅嘴相思鳥(niǎo)進(jìn)行性別鑒定，探討不同市場(chǎng)上紅嘴相思鳥(niǎo)種群性比?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究主要通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)紅嘴相思鳥(niǎo)進(jìn)行性別鑒定，探討全國(guó)范圍內(nèi)不同市場(chǎng)上的紅嘴相思鳥(niǎo)種群性比，同時(shí)驗(yàn)證市場(chǎng)利用形態(tài)鑒定紅嘴相思鳥(niǎo)性別的準(zhǔn)確率，以此來(lái)評(píng)估其種群整體性比狀況及其貿(mào)易捕捉是否存在性別選擇，為野生紅嘴相思鳥(niǎo)種群的保護(hù)和管理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 血液樣本采集

2018年11月—2019年6月，實(shí)地調(diào)查市場(chǎng)中紅嘴相思鳥(niǎo)的貿(mào)易現(xiàn)狀及部分鳥(niǎo)市基于形態(tài)特征的性比狀況，并采集紅嘴相思鳥(niǎo)血液樣本10～20μL用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。共采集到血液樣本361份，采集地分布見(jiàn)表1。

表1 采集地分布表Tab.1 Distribution of collection sites

1.2 分子生物學(xué)方法性別鑒定

1.2.1 DNA提取 采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取樣本DNA，4 ℃保存待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 在通用引物P2∕P8基礎(chǔ)上，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，再用獲得序列重新設(shè)計(jì)專(zhuān)一性更高的引物，引物設(shè)計(jì)在NCBI網(wǎng)站完成。為保證鑒定體系的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中對(duì)PCR體系進(jìn)行不同設(shè)定以摸索出最優(yōu)反應(yīng)條件。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。個(gè)體性別判斷標(biāo)準(zhǔn)為雄性1條條帶，雌性2條條帶，每個(gè)樣本電泳結(jié)果3次一致則確定其性別，對(duì)于不能成功擴(kuò)增或結(jié)果不一致的個(gè)體則舍棄。

1.3 形態(tài)學(xué)性別鑒定

14個(gè)采樣組中有7組進(jìn)行了紅嘴相思鳥(niǎo)的形態(tài)學(xué)性別鑒定，通過(guò)詢問(wèn)市場(chǎng)攤主，由其根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行性別判定，即:（1）胸部紅色區(qū)域更寬者為雄；（2）翅膀上黃色斑塊更大為雄；（3）具黃色眼紋為雄等。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以分子生物學(xué)鑒定性別的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算市場(chǎng)上形態(tài)學(xué)鑒定方法的準(zhǔn)確率（A），雄性鑒定準(zhǔn)確率（AM）和雌性鑒定準(zhǔn)確率（AF）[21]，并計(jì)算紅嘴相思鳥(niǎo)貿(mào)易種群的實(shí)際性比（R）。

式中，NM、NF、NT分別為雄性鑒定正確個(gè)數(shù)、雌性鑒定正確個(gè)數(shù)和樣本總數(shù)，NM0，NF0分別為用于性別鑒定的雄性個(gè)體數(shù)和雌性個(gè)體數(shù)。NM1和NT1分別為分子生物學(xué)成功鑒定的雄性個(gè)數(shù)和樣本總數(shù)。

所有數(shù)據(jù)均在Excel2013及SPSS19.0軟件中進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 性別鑒定引物及其效果

對(duì)原P2引物序列進(jìn)行了改進(jìn)，獲得了新引物A1，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 μL，含2×GoTaq?Green Master Mix 5μL，Nuclease-Free Water 3 μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火溫度1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，A1∕P8退火溫度（51±1）℃。

利用A1∕P8引物對(duì)紅嘴相思鳥(niǎo)性別進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果與P2∕P8引物的鑒定結(jié)果一致，但A1∕P8引物PCR擴(kuò)增條帶更清晰、穩(wěn)定（圖1）。

圖1 不同引物的擴(kuò)增結(jié)果比較Fig.1 Comparison of amplification results of different primers

2.2 性比結(jié)果

利用新的引物成功鑒定出361份樣本的性別，成功率100%。其中雄鳥(niǎo)163只，雌鳥(niǎo)199只。整體性比為0.45，偏雌。在14個(gè)采樣組中有5組性比偏雄，7組性比偏雌，2組性比基本平衡（表3，圖2）。

2.3 分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定比較

7個(gè)采樣組的紅嘴相思鳥(niǎo)形態(tài)學(xué)性別鑒定結(jié)果為雄性114只，雌性65只。由表3可知，形態(tài)性別鑒定的總準(zhǔn)確率為0.79，其中雄性準(zhǔn)確率為0.82，高于雌性（0.74）；7個(gè)采樣組的性別鑒定準(zhǔn)確率不同，僅有1組準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

表3 分子生物學(xué)性別鑒定結(jié)果Tab.3 Results of sex identification in molecular biology

圖2 不同采集點(diǎn)紅嘴相思鳥(niǎo)性比結(jié)果Fig.2 Sex ratio of Leiothrix lutea collected from different sites

表4 形態(tài)學(xué)性別鑒定準(zhǔn)確率Tab.4 Accuracy rate of morphological sex identification

3 討論

紅嘴相思鳥(niǎo)雌雄在形態(tài)上的差別很難通過(guò)肉眼進(jìn)行有效分辨[22]。盡管市場(chǎng)認(rèn)為不同性別紅嘴相思鳥(niǎo)在形態(tài)上存在差異，但這些差別的可靠性沒(méi)有經(jīng)過(guò)科學(xué)驗(yàn)證。有研究采用比色法來(lái)檢驗(yàn)紅嘴相思鳥(niǎo)雌雄的體色差異，結(jié)果顯示眾多測(cè)量參數(shù)中沒(méi)有任何形態(tài)學(xué)參數(shù)證明在雌雄間存在顯著差異，采用單一形態(tài)參數(shù)預(yù)測(cè)雌雄的結(jié)果準(zhǔn)確率很低[23]。本文在驗(yàn)證形態(tài)性別鑒定法的準(zhǔn)確率時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)其準(zhǔn)確率達(dá)不到100%，個(gè)別鳥(niǎo)市不足50%，說(shuō)明形態(tài)學(xué)鑒定方法嚴(yán)重依賴于鑒定者的經(jīng)驗(yàn)，存在不確定性和顯著的個(gè)體差異，且對(duì)雌性的誤判率更高。因此，采用分子生物學(xué)方法對(duì)紅嘴相思鳥(niǎo)進(jìn)行性別鑒定仍然是最可靠的方法。本文利用引物A1∕P8進(jìn)行分子生物學(xué)性別鑒定，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定，優(yōu)于通用引物，可以應(yīng)用于紅嘴相思鳥(niǎo)及其近源物種的性別鑒定。

成年性比呈雄性偏倚現(xiàn)象在許多鳥(niǎo)類(lèi)中已被證明是普遍存在的，特別是在受威脅的物種和小的或分散的種群中[24-28]。Emilio等[23]在西班牙東北部的巴塞羅那采用陷阱法和霧網(wǎng)法分別在不同地點(diǎn)捕捉了57只紅嘴相思鳥(niǎo)，其中33只為雄鳥(niǎo)，24只為雌鳥(niǎo)，性比為0.579，略偏雄。本研究中紅嘴相思鳥(niǎo)整體成年性比略偏雌，與Emilio等的結(jié)果相反。但不同市場(chǎng)上的性比結(jié)果差異很大，例如南昌、合肥和梧州等鳥(niǎo)市的性比結(jié)果嚴(yán)重偏雌，西安和成都等鳥(niǎo)市性比結(jié)果則嚴(yán)重偏雄。

寵物鳥(niǎo)常常因雄鳥(niǎo)顏色更為艷麗，叫聲更為悅耳，導(dǎo)致價(jià)格更高，有可能會(huì)誘使捕鳥(niǎo)人偏好捕捉雄鳥(niǎo)。經(jīng)市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果統(tǒng)計(jì)，部分市場(chǎng)雄性紅嘴相思鳥(niǎo)價(jià)格更高，且數(shù)量更多。因此，部分市場(chǎng)上紅嘴相思鳥(niǎo)性比偏雄的原因可能與非法捕捉中的性別篩選有關(guān)，但該理由不能解釋雌鳥(niǎo)更多的市場(chǎng)結(jié)果；實(shí)際上，紅嘴相思鳥(niǎo)雌雄差異整體不顯著，多數(shù)市場(chǎng)上紅嘴相思鳥(niǎo)的價(jià)格也沒(méi)有雌雄差異，所以由選擇偏好導(dǎo)致的捕捉上的性比偏倚應(yīng)不是普遍現(xiàn)象?？紤]到紅嘴相思鳥(niǎo)的捕捉上市時(shí)間以秋季為主，此時(shí)紅嘴相思鳥(niǎo)常成群活動(dòng)，采用網(wǎng)捕法很難篩選性別，因此，市場(chǎng)上紅嘴相思鳥(niǎo)的性比結(jié)果可以反映野外種群的實(shí)際情況，即很可能存在地區(qū)性性比偏倚現(xiàn)象。紅嘴相思鳥(niǎo)為留鳥(niǎo)，但季節(jié)性集群垂直遷移明顯[3,29]，誘引眾多捕鳥(niǎo)人前往其活動(dòng)點(diǎn)張網(wǎng)捕捉，且捕獲數(shù)量大[2]，網(wǎng)捕個(gè)體來(lái)自同一群體的概率大，推測(cè)單次購(gòu)買(mǎi)的鳥(niǎo)有很高概率是來(lái)自同一地區(qū)。從每個(gè)市場(chǎng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，大部分存在性比上的顯著差異，僅2個(gè)采集地性比平衡。因此，推測(cè)紅嘴相思鳥(niǎo)不同地理群體的成年性比存在差異，其中個(gè)別地理種群性比偏倚可能較為嚴(yán)重。

成年性比（ASR）會(huì)影響個(gè)體的繁殖或社會(huì)地位，以及終生的繁殖成功[30]，且會(huì)對(duì)種群數(shù)量產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。然而在多數(shù)物種的保護(hù)當(dāng)中成年性比沒(méi)有得到足夠的重視。紅嘴相思鳥(niǎo)作為我國(guó)重要的觀賞鳥(niǎo)類(lèi)，濫捕濫獵情形仍然嚴(yán)重，其野外資源亟需保護(hù)。本研究結(jié)果是紅嘴相思鳥(niǎo)貿(mào)易種群成年性比的情況，雖然會(huì)受無(wú)法排除的人為因素影響（例如多來(lái)源、人工篩選等），仍可一定程度上反映出野外群體性比的實(shí)際狀況及貿(mào)易對(duì)種群性比的影響，但仍需野外種群調(diào)查結(jié)果的驗(yàn)證。

致謝：中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所雷富民研究員、宋剛副研究員、貴州大學(xué)粟海軍教授、陜西動(dòng)物所羅磊副研究員、劉濤、塔旗等在樣品采集中提供了幫助，謹(jǐn)致謝意！