羅昕 徐梓馨 周璀 徐銘益

MicroRNA(miRNA)是一類在人體中廣泛分布非編碼小RNA，有多種miRNA如miR-29a、miR-223等與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)疾病的進展有關(guān)[1-4]。肝細胞的脂質(zhì)沉積及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致脂肪肝的核心環(huán)節(jié)[5，6]。本研究通過構(gòu)建脂肪肝小鼠模型及脂肪肝細胞模型，了解在高脂環(huán)境下miR-194調(diào)控肝細胞脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的作用。

材料與方法

一、材料與試劑

實驗小鼠購于上海斯萊克實驗動物中心，LO2細胞系購于中科院上海細胞庫。小鼠低脂飼料及高脂飼料均購于南通特洛菲實驗飼料有限公司，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，1%青霉素鏈霉素雙抗溶液、棕櫚酸、LipofectamineTM3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，TNF-α單克隆熒光抗體購自美國Abcam公司，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒，HE染色、油紅染色試劑盒均購于上海懿圣生物科技有限公司。

二、方法

(一)動物模型構(gòu)建 共有10只8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠用于脂肪肝小鼠模型的構(gòu)建。小鼠體質(zhì)量為25～30 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實驗動物中心。10只小鼠隨機分為低脂組(LFD)與高脂組(NFD)，每組5只，LFD組小鼠喂養(yǎng)普通飼料(即低脂飼料)，HFD組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料。喂養(yǎng)相應(yīng)飼料16周后處死小鼠，取部分肝組織經(jīng)脫水、石蠟包埋或OCT凝膠包埋用于病理學(xué)檢測。取適當(dāng)組織行qPCR檢測，余組織凍存于液氮中。

(二)肝組織病理檢查 建模小鼠處死后，取適當(dāng)大小的新鮮組織塊置于4%甲醛溶液中固定48 h，后常規(guī)脫水處理，石蠟包埋。蠟塊以4 μm切片用以HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理改變。

新鮮肝組織經(jīng)過4%甲醛中固定48 h，依次經(jīng)過20%、10%蔗糖溶液梯度各24 h脫水后，用OCT溶膠包埋。以10 μm厚度進行冰凍組織切片，用于油紅染色，光學(xué)顯微鏡下檢測其病理程度并拍照。

(三)細胞培養(yǎng) 采用含有10%FBS及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝細胞系LO2，細胞培養(yǎng)置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。待細胞融合度達到70%時行細胞傳代。用0.25%胰蛋白酶消化細胞后，以1∶3的比例行細胞傳代。

(四)細胞轉(zhuǎn)染 用0.25%的胰酶消化細胞后，以1×105/孔的密度將生長狀態(tài)良好的LO2細胞接種于十二孔板中，置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日觀察細胞生長狀態(tài)，細胞透亮伸展，融合度達到約80%時細胞轉(zhuǎn)染處理。使用 LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染。細胞分為空白轉(zhuǎn)染對照組(miR-NC組)和miR-194過表達組(miR-194)，分別轉(zhuǎn)染micro-RNA 陰性對照mimics和microRNA-194 mimics,轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/mL，轉(zhuǎn)染完成48 h后收集細胞，以200 μmol PA刺激LO2細胞24 h(模擬高脂環(huán)境)。

(五)RT-qPCR檢測相關(guān)基因miRNA及mRNA表達 建模后的小鼠組織及轉(zhuǎn)染后的LO2細胞按照說明書提取總RNA，檢測RNA純度及豐度。按照說明書將獲取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix染料進行qPCR擴增。目的基因相對表達量采用 △△CT 方法計算，目的基因的相對表達率(relative expression，RQ)=2-△△CT。miRNA的檢測以U6作為內(nèi)參，mRNA的檢測以GAPDH作為內(nèi)參。內(nèi)參基因及目標(biāo)基因均設(shè)3個復(fù)孔。各基因引物見表1。

表1 qPCR相關(guān)引物序列

(六)LO2細胞油紅染色 取生長狀態(tài)良好的LO2細胞接種于十二孔板中，接種密度為1×105/孔，行細胞轉(zhuǎn)染，在細胞瞬轉(zhuǎn)完成后的24 h后更換濃度為200 μmol PA的完全培養(yǎng)基進行高脂處理24 h。細胞處理完成后，按照說明書進行細胞油紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞脂質(zhì)沉積。

(七)免疫熒光檢測LO2細胞TNF-α表達 生長狀態(tài)良好的LO2細胞接種于十二孔板細胞爬片中，接種密度為 1×105/孔。完成預(yù)處理的細胞爬片后用4%多聚甲醛固定15 min, 然后以0.2%Triton X-100室溫通透20 min; 5%BSA溶液, 室溫封閉30 min;以1∶100稀釋一抗孵育細胞爬片并入濕盒, 4 ℃孵育過夜，以上各步驟之間以PBS浸洗3次, 每次3 min;次日室溫復(fù)溫1 h, 以1∶200的濃度稀釋熒光二抗, 濕盒中室溫孵育爬片1 h。滴加DAPI避光孵育5 min, 對標(biāo)本進行染核, 并用含抗熒光淬滅劑的封片液封片, 在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

結(jié) 果

一、脂肪肝小鼠造模情況

LFD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，細胞核居于細胞正中，無明顯脂肪變性及氣球樣變(圖1A)。HFD組小鼠可見肝小葉中肝細胞排列紊亂，細胞出現(xiàn)明顯的脂肪變性及氣球樣變，有大量炎細胞浸潤(圖1B)。油紅染色顯示，LFD組小鼠細胞形態(tài)正常，肝臟脂質(zhì)沉積較少(圖1C)；HFD組小鼠可見胞內(nèi)大量鮮紅色脂滴沉積(圖1D)。HE染色及油紅染色顯示脂肪肝小鼠模型成功構(gòu)建。

A：低脂小鼠(HE染色×100)；B：高脂小鼠(HE染色×100)；C：低脂小鼠(油紅染色×100)；D：高脂小鼠(油紅染色×100)

二、miR-194在脂肪肝小鼠肝組織中明顯下降

LFD組小鼠組為miR-194的相對表達水平為1.000±0.147，HFD組為0.634±0.116, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.478,P=0.025)。說明在脂肪肝的病理過程中，miR-194表達受到了抑制，相關(guān)功能受到了影響。

三、脂肪肝小鼠肝組織中脂質(zhì)合成基因及炎癥相關(guān)基因表達明顯上升

與LFD小鼠相比，在HFD組小鼠肝臟組織中促脂質(zhì)合成基因SCD1及ACC的表達都顯著上調(diào)，分別為[LFD:1.000±0.287，HFD:1.658±0.216, (t=4.802,P=0.009]和[LFD:1.000±0.252，HFD:1.851±0.245, (t=4.194,P=0.015)]。SCD1和ACC1是脂質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，能夠促進肝細胞脂質(zhì)的合成，促進脂質(zhì)在細胞內(nèi)沉積。此外，與LFD小鼠相比，HFD小鼠的TNF-α及IL-6表達明顯上調(diào)[LFD:1.000±0.172，HFD:1.952±0.147, (t=7.288,P=0.002)]和[LFD:1.000±0.207，HFD:1.452±0.108, (t=3.242,P=0.029)]。這表明，隨著脂質(zhì)沉積于肝細胞內(nèi)，細胞的炎癥反應(yīng)增多，氧化應(yīng)激明顯加強。

四、高脂環(huán)境下，miR-194高表達可以緩解LO2細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

QPCR結(jié)果顯示miR-194在LX2內(nèi)升高約1 100倍，過表達miR-194 LO2細胞模型成功構(gòu)建。此外，qPCR檢測SCD1和ACC表達，可以發(fā)現(xiàn)在過表達miR-194后的LO2細胞內(nèi), SCD1[miR-NC:1.000±0.149，miR-194:0.625±0.112, (t=3.340,P=0.029)]和ACC[miR-NC:1.000±0.204，miR-194:0.572±0.124, (t=3.105,P=0.038)]表達明顯下調(diào)。油紅染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，同樣可以發(fā)現(xiàn)過表達miR-194的LO2細胞內(nèi)紅色脂肪顆粒明顯變少(圖2)。以上結(jié)果表明，在高脂環(huán)境下，miR-194可以明顯LO2細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。

A：miR-NC; B:miR-194

五、高脂環(huán)境下，miR-194高表達可以緩解LO2細胞內(nèi)炎癥反應(yīng)

結(jié)果表明與miR-NC組LO2相比，過表達miR-194的LO2細胞中TNF-α [miR-NC:1.000±0.149，miR-194: 0.563±0.059, (t=4.723,P=0.009)]及IL-6[miR-NC:1.000±0.156，miR-194:0.685±0.112, (t=2.853,P=0.048)]的mRNA表達水平顯著下降。免疫熒光檢測二組細胞中TNF-α表達情況，可以發(fā)現(xiàn)過表達miR-194的LO2細胞內(nèi)紅熒光程度明顯降低，相對強度為[miR-NC:1.000±0.124，miR-194:0.655±0.152, (t=3.020,P=0.039)]，TNF-α表達明顯下降(圖3)。以上結(jié)果表明在高脂環(huán)境下，miR-194可以明顯減輕LO2細胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

A：miR-NC; B:miR-194

討 論

He等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-233可以通過減輕高脂環(huán)境下肝細胞的炎癥反應(yīng)使脂肪肝的進展減緩。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)miR-27a可以通過靶向調(diào)控肝細胞FAS及SCD1基因，抑制其脂質(zhì)合成從而促進脂肪肝的進展。MiR-194是肝臟中豐度最高的RNA[9]。Wu等[10]在肝星狀細胞中發(fā)現(xiàn)miR-194可以通過靶向調(diào)控AKT2 基因 延緩肝纖維化的進展。RAN等[11]發(fā)現(xiàn) miR-194可以通過靶向調(diào)控肝癌細胞RAC1基因延緩肝癌的進展。本研究結(jié)果表明，與低脂組小鼠相比高脂小鼠肝細胞脂肪變性明顯，有大量脂肪滴沉積與肝臟內(nèi)，脂肪肝小鼠模型成功構(gòu)建。通過qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)miR-194在高脂小鼠肝臟內(nèi)表達明顯降低，說明在脂肪肝進程中，miR-194的功能受到了抑制。

本研究中，在棕櫚酸刺激LO2后，采用qPCR檢測miR-NC組及過表達miR-194組細胞的脂質(zhì)合成因子表達，發(fā)現(xiàn)ACC及SCD1表達明顯減少。ACC和SCD1均為脂肪酸合成步驟過程中的限速酶，其豐度的高低可以作為顯示脂質(zhì)合成的活躍情況[12]。油紅染色進一步表明在過表達miR-194組，細胞內(nèi)的脂肪沉積明顯減少。這證明miR-194起到了減緩細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的作用。采用qPCR檢測對照組及過表達miR-194 LO2細胞內(nèi)的炎癥因子的表達，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6的表達都在過表達組中出現(xiàn)了明顯的下降。TNF-α、IL-6是經(jīng)典的炎癥因子，其豐度可以表明目前細胞的炎癥反應(yīng)狀態(tài)。此外，通過免疫熒光檢測TNF-α的表達，可以發(fā)現(xiàn)在過表達組中LO2細胞紅熒光顯著減弱，這表明TNF-α的表達顯著下降。這些結(jié)果表明miR-194可以減少高脂環(huán)境下LO2細胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，通過體內(nèi)實驗及體外實驗的結(jié)果表明miR-194可以負向調(diào)控高脂環(huán)境下肝臟的脂質(zhì)合成及炎癥反應(yīng)，起到保護肝臟的作用，有望成為治療NAFLD的新靶點。而miR-194在脂肪肝進程中起到保護作用的具體機制及下游靶基因的調(diào)控需要進一步的研究證實。