宋 菲，黃 瑤，張利明，殷錫峰，戴榮貴，江 俊

(1.鎮(zhèn)江市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212202；2.鎮(zhèn)江威特藥業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇鎮(zhèn)江 212202)

氟苯尼考是一種動(dòng)物專(zhuān)用的半合成酰胺醇類(lèi)抗生素，有眾多的優(yōu)點(diǎn)，抗菌譜廣，動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，注射或內(nèi)服均吸收良好，既無(wú)潛在致再生障礙性貧血作用，也無(wú)致畸、致癌或致突變作用。氟苯尼考能有效治療由巴氏桿菌和睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸道系統(tǒng)疾病，可用于防控豬胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌和巴氏桿菌引起的豬呼吸道疾病，也可有效治療魚(yú)類(lèi)的細(xì)菌感染，因此在畜禽養(yǎng)殖中的使用日益頻繁。隨著氟苯尼考的廣泛使用，動(dòng)物源性食品中氟苯尼考?xì)埩魡?wèn)題也引起消費(fèi)者的擔(dān)憂(yōu)，加強(qiáng)氟苯尼考?xì)埩舯O(jiān)控需建立特異性高、靈敏度好的檢測(cè)方法。目前，針對(duì)氟苯尼考?xì)埩袅繖z測(cè)方法包括微生物法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS)和氣相色譜法。其中微生物法的靈敏度和特異性較差，且操作煩瑣；酶聯(lián)免疫吸附法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度較差；高效液相色譜法準(zhǔn)確性高，特異性好，但靈敏度同樣較差；HPLC-MS/MS準(zhǔn)確性高，靈敏度高，特異性好，雖然對(duì)儀器設(shè)備要求較高，但是極高的靈敏度更適合監(jiān)控食品中的氟苯尼考?xì)埩鬧1-3]。本研究通過(guò)分析比較氟苯尼考檢測(cè)方法，優(yōu)化前處理以及色譜條件，建立了一種準(zhǔn)確性高、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測(cè)豬可食性組織中氟苯尼考?xì)埩袅康囊合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

氟苯尼考和氟苯尼考胺對(duì)照品：含量均為99.5%，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。乙腈、甲醇和甲酸為色譜純，乙酸乙酯、正己烷、氨水、乙酸銨為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLCMS/MS)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，型號(hào)Thermo Scientific TSQ Endura]。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

氟苯尼考儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 氟苯尼考于50 mL 容量瓶，乙腈定溶，配制成200 μg/mL 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

氟苯尼考胺儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 氟苯尼考胺于50 mL 容量瓶，甲醇定溶，配制成200 μg/mL 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別量取適量200 μg/mL 氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋?zhuān)瞥? ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL 和4 000 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 其他溶液配制

3%氨水-乙酸乙酯溶液：準(zhǔn)確量取30 mL 氨水，加入970 mL 乙酸乙酯混勻即可。

2 方法

2.1 制備試樣

取均質(zhì)后的空白豬肉樣品，作為空白試料；取均質(zhì)后的空白豬肉樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為空白添加試料。

2.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取攪碎后的豬肉樣品5.00 g(±0.05 g)，裝入50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL 3%氨水-乙酸乙酯液，渦旋混勻5 min，在10 ℃下10 000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一50 mL 聚丙烯離心管中。下層殘?jiān)儆?0 mL 的3%氨水-乙酸乙酯液提取一次，合并以上兩次上清液，備用。

移取以上備用液5 mL，50 ℃氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL 流動(dòng)相復(fù)溶，加入5 mL 正己烷漩渦混勻30 s，然后以5 000 r/min 離心10 min，收集下層水相，再用5 mL 正己烷重復(fù)凈化一次，最后用0.22 μm 的無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾水相，濾液用(HPLC-MS/MS)檢測(cè)。

2.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取適量系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入“2.2樣品處理”所述殘?jiān)鼜?fù)溶后的空白溶液，制備空白基質(zhì)溶液，使其進(jìn)樣終濃度為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、4 000 ng/mL，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。

2.4 儀器條件

色譜柱：安捷倫科技有限公司的Agilent Zebox C18 色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相A 為0.1%氨水，流動(dòng)相B 為乙腈，流速300 μL/min，進(jìn)樣量25 μL，柱溫40 ℃。液相洗脫梯度：0 min～1 min 維持85% A；1 min～2 min 線性變化至15% A；2 min～3 min 維持15% A；3 min～4 min線性變化至85% A；4 min～5 min 維持85% A。

電離源：電噴霧離子源，采用正/ 負(fù)離子混合模式；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式；傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃；干燥氣溫度300 ℃；鞘氣壓力310.26 kpa；輔助氣流速12 L/min；Ion Sweep 氣體壓力13.79 kPa；電子倍增器電壓3 700(+)/3 500(-) v；碰撞氣為高純氬氣(純度為99.99%)；離子源選擇電噴霧離子源(ESI)。氟苯尼考胺選擇248.1/229.9(定量離子)，碰撞能量10，248.1/130.1(定性離子)，碰撞能量20；氟苯尼考選擇，－355.9/－335.9(定量離子)，碰撞能量13，－355.9/－184.9(定性離子)，碰撞能量19。

2.5 檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)的確定

5 個(gè)空白豬肉平行樣品，按照“2.2 樣品處理”所述方法前處理后上儀器檢測(cè)，測(cè)得基線噪音，將信噪比≥3 時(shí)的濃度定為檢測(cè)限，信噪比≥10 時(shí)的濃度為定量限。

2.6 準(zhǔn)確性

準(zhǔn)確性用添加樣品回收率表示，于 50 mL聚丙烯的離心管中稱(chēng)取3 份5.00 g(±0.05 g)均質(zhì)好的空白豬肉樣品，每份樣品分別加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.1 mL，使混合標(biāo)準(zhǔn)工作液在各樣品中的濃度分別為20 ng/g、40 ng/g和1 000 ng/g。通過(guò)“2.2 樣品處理”所述方法前處理后，上機(jī)檢測(cè)的各樣品最終上機(jī)濃度為10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/g，進(jìn)樣體積為25 μL，HPLC-MS/MS 測(cè)定定量離子峰面積，同時(shí)用HPLC-MS/MS 測(cè)定對(duì)應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/mL)的定量離子峰面積。各個(gè)濃度分別重復(fù)5 次，回收率的計(jì)算公式如下：

式中：A 為預(yù)處理后組織中氟苯尼考、氟苯尼考胺的實(shí)測(cè)定量離子峰面積；

AS 為對(duì)應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液中氟苯尼考、氟苯尼考胺的定量離子峰面積。

2.7 精密度

精密度以空白豬肉添加樣品測(cè)定的日間變異系數(shù)和日內(nèi)變異系數(shù)表示。稱(chēng)取3 份5.00 g(±0.05 g)均質(zhì)的空白豬肉樣品，裝入50 mL 聚丙烯離心管，分別加入1 000 ng/mL、50 000 ng/mL、200 000 ng/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.1 mL，使混標(biāo)在各組織中的濃度分別為20 ng/g、1 000 ng/g 和4 000 ng/g。按“2.2 樣品處理”所述的方法處理，上機(jī)檢測(cè)的各組織最終濃度為10 ng/g、500 ng/g、2 000 ng/g，取25 μL 濾液進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定，同時(shí)用25 μL 對(duì)應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL)，進(jìn)行HPLC-MS/MS 測(cè)定。各濃度樣品同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定5 次，HPLC-MS/MS 測(cè)得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量離子峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各樣品藥物濃度，求出日內(nèi)變異系數(shù)。一周內(nèi)5 d 分別檢測(cè)三個(gè)濃度樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5 次，HPLC-MS/MS 測(cè)得氟苯尼考、氟苯尼考胺定量離子峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各樣品藥物濃度，求出日間變異系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)

在以上質(zhì)譜條件下，氟苯尼考和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)工作液(藥物濃度在10 μg/kg～4 000 μg/kg 范圍內(nèi))各個(gè)濃度與其峰面積成良好的線性關(guān)系(R2≥0.99)，方法的檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)分別為5 μg/kg 和10 μg/kg。氟苯尼考回歸方程為Y ＝9 816.3x ＋301 250，R2＝0.998；氟苯尼考胺回歸方程為Y ＝67 312x－403 487，R2＝0.999。

3.2 添加回收率與精密度

對(duì)10 ng/mL、500 ng/mL、2 000 ng/mL三個(gè)樣品添加濃度進(jìn)行回收率測(cè)定，添加回收率與精密度結(jié)果見(jiàn)表1 和表2。

4 討論

4.1 氟苯尼考?xì)埩袅繖z測(cè)

氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的提取方法有許多，提取試劑通常為乙酸乙酯、乙腈、甲醇和丙酮等。比較不同的提取試劑對(duì)回收率的影響，甲醇和乙腈提取率較差，回收率較低；氟苯尼考胺為弱堿性物質(zhì)，用乙酸乙酯提取時(shí)加入適量氨水。提取效果更佳，回收率也更高。相對(duì)于用丙酮或二氯甲烷提取，用乙酸乙酯加氨水混合后提取，帶入的干擾物質(zhì)較少，可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化凈化過(guò)程，無(wú)須固相萃取小柱的凈化，極大節(jié)約了樣品前處理的成本，故本試驗(yàn)選擇乙酸乙酯氨水混合溶液為提取試劑。

用強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化時(shí)，氟苯尼考、氟苯尼考胺的回收率為70%～75%，在進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)時(shí)，不過(guò)柱處理，將備用液直接氮吹，之后用水復(fù)溶，經(jīng)過(guò)兩次正己烷凈化處理后，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率均能達(dá)到85%以上，并且凈化液在通過(guò)0.22 μm 的濾膜時(shí)無(wú)阻力，濾液清澈，說(shuō)明此方法符合要求。

本研究流動(dòng)相A 為0.1%氨水，流動(dòng)相B為乙腈，弱極性的氟苯尼考保留性較強(qiáng)，而極性較強(qiáng)的氟苯尼考胺保留性較弱，保留時(shí)間不到2 min，因此選擇低流速0.3 mL/min 以延長(zhǎng)氟苯尼考胺的保留時(shí)間。氟苯尼考質(zhì)譜條件較為成熟，負(fù)模式電噴霧離子源定性離子為－184.9，定量離子為－335.9。氟苯尼考胺為堿性樣品，在正模式電噴霧離子源掃描下，130.1 為定性離子，229.9 為定量離子。在此條件下其豐度值大，受雜質(zhì)干擾小。本試驗(yàn)中，在氟苯尼考胺保留時(shí)間之前，通過(guò)切換閥將流動(dòng)相中強(qiáng)干擾物質(zhì)切換到廢液中，可以減少對(duì)目標(biāo)物的干擾。

4.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

本研究建立的氟苯尼考?xì)埩袅繖z測(cè)方法，其檢測(cè)限和定量限分別為5 μg/kg 和10 μg/kg。在10 μg/kg～4 000 μg/kg范圍內(nèi)，氟苯尼考和氟苯尼考胺在各組織的空白添加標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99 以上。各組織空白樣品添加濃度在10 μg/kg、500 μg/kg 和2 000 μg/kg 時(shí)，回收率均大于85%，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于3%。該方法適用于豬可食性組織中氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定。