牛沖，竇艷麗，婁紅祥，徐玉文

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省仿制藥一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2.山東大學(xué),山東 濟(jì)南 250014)

美洛西林鈉(Mezlocillin Sodium)屬于第三代半合成青霉素類抗菌藥物，由德國(guó)拜耳公司研發(fā)。美洛西林主要對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性球菌及放線菌等高度敏感，且對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌有效。主要通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽的合成，使之不能交聯(lián)而造成細(xì)胞壁的缺損，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。用于大腸埃希菌、腸桿菌屬、變形桿菌等革蘭陰性桿菌中敏感菌株所致的呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、婦科和生殖器官等感染[1-7]。

美洛西林鈉收載于《美國(guó)藥典》第40版(USP40)、《中國(guó)藥典》2015年版(ChP.2015)(二部)[8]。USP35中未對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制。ChP.2015中對(duì)有關(guān)物質(zhì)采用等度洗脫方法進(jìn)行控制，2014年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)法定檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在藥典規(guī)定的時(shí)間之外仍有雜質(zhì)檢出。彭力等[9]采用梯度洗脫方法對(duì)美洛西林鈉雜質(zhì)進(jìn)行了研究，雜質(zhì)檢出的數(shù)量及雜質(zhì)總量均明顯增加，但其分析檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，不適合質(zhì)量控制，且改進(jìn)的方法中最初的等度洗脫階段與藥典方法一致，此階段，美洛西林鈉的合成中間體氨芐西林的色譜峰與溶劑峰重合，溶劑存在干擾。基于以上原因，我們通過(guò)對(duì)原料合成中間體及降解產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察，優(yōu)化了測(cè)定方法，改進(jìn)后的方法雜質(zhì)檢出能力明顯提高，更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)；島津LC-20at高效液相色譜儀；BP211D電子天平。

1.2 試藥 注射用美洛西林鈉(樣品來(lái)自2014年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)，共204批次，美洛西林鈉原料、氨芐西林、氯甲酰物由山東瑞陽(yáng)制藥股份有限公司提供)。水為去離子水，乙腈為色譜純。

2 方法考察

2.1 藥典方法檢測(cè) 色譜柱：Thermo BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，流速：1.2 mL· min-1，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A[磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀4.9 g和磷酸氫二鉀0.45 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL)]-流動(dòng)相B(乙腈)=80∶20。記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的1.5倍，色譜圖見圖1?？梢娫谥鞣灞Ａ魰r(shí)間4倍以外，仍有色譜峰檢出，該方法易造成雜質(zhì)的漏檢，需對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)。

圖1 按藥典方法測(cè)定供試品溶液色譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 洗脫方式由等度洗脫變?yōu)樘荻认疵?，其余色譜條件同“2.1”項(xiàng)下，0～18 min，A：90%～65%；18～27 min，A：65%；27.01 min，A：90%。

供試品溶液：取本品60 mg，精密稱定，加水溶解并稀釋至100 mL，搖勻。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液1.0 mL，加水稀釋至100 mL，搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液：取供試品溶液，水浴加熱8 min。按上述方法測(cè)定，理論板數(shù)按美洛西林峰計(jì)為51 388，美洛西林峰與前后雜質(zhì)分離度分別為2.05和1.89(見圖2)，系統(tǒng)適用性良好。

圖2 系統(tǒng)適用性色譜圖

2.3 波長(zhǎng)的選擇 采用DAD檢測(cè)器對(duì)美洛西林及破壞性試驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)定，美洛西林及降解產(chǎn)物均為紫外末端吸收，故參照ChP.2015方法，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為210 nm。

2.4 專屬性試驗(yàn) 溶劑無(wú)干擾。

酸破壞考察：取美洛西林鈉原料(批號(hào)：14011641)60 mg，置100 mL量瓶中，加水50 mL溶解，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液5 mL，放置30 min，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。

堿破壞考察：取美洛西林鈉原料(批號(hào)：14011641)60 mg，置100 mL量瓶中，加水50 mL溶解，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，放置30 min，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。

氧化破壞考察：取美洛西林鈉原料(批號(hào)：14011641)60 mg，置100 mL量瓶中，加水50 mL溶解，加30% H2O25 mL，放置30 min，用水稀釋至刻度，搖勻。

光照破壞考察：取美洛西林鈉原料(批號(hào)：14011641)60 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，置254 nm紫外燈下放置24 h。

加熱破壞：取美洛西林鈉原料(批號(hào)：14011641)，80 ℃加熱2 h，稱取60 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣考察，色譜圖見圖3。上述破壞條件下產(chǎn)生的各降解雜質(zhì)與美洛西林的色譜峰的分離度均符合要求。

2.5 定量限與檢出限 精密量對(duì)照溶液(批號(hào)：14011641)3 mL，用水稀釋至200 mL，搖勻，精密量取5 mL，用水稀釋至100 mL，進(jìn)樣20 μL，以信噪比為10計(jì)算，定量限為9 ng，進(jìn)樣7 μL，以信噪比為3計(jì)算，檢出限為3 ng。

2.6 精密度試驗(yàn) 取美洛西林鈉(批號(hào)：14011641)，于同一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定5份有關(guān)物質(zhì)，單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)含量的RSD分別為0.54%和0.62%，日內(nèi)精密度良好。另取美洛西林鈉(批號(hào)：14011641)連續(xù)5 d每天測(cè)定一份有關(guān)物質(zhì)，單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)含量的RSD分別為0.32%和0.24%，日間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取美洛西林鈉(批號(hào)：14011641)按“2.2”方法，分別與0、1、2、4、6 h進(jìn)樣測(cè)定，保留時(shí)間為10.2的雜質(zhì)由0.18%增加至0.32%；從2 h開始，保留時(shí)間2.6 min處出現(xiàn)一雜質(zhì)峰，其含量0.23%；雜質(zhì)總和由2.96%增加至3.32%。提示本品不穩(wěn)定，應(yīng)臨用現(xiàn)制。

A.原料(API)；B.酸破壞樣品；C.堿破壞樣品；D.氧化破壞樣品；E.加熱破壞樣品；F.光破壞樣品圖3 HPLC色譜圖

2.8 1%自身對(duì)照溶液線性考察 精密量取美洛西林鈉(批號(hào)：14011641)供試品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別用水稀釋至200 mL，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣測(cè)定，以美洛西林的峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，Y=2 470.8X+7 166.7 (r=0.999 9)。結(jié)果表明，美洛西林在30.07～240.56 ng范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.9 耐用性考察 取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，分別采用Waters Symmery C18(5 μm， 4.6 mm×150 mm)、Welchrom C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，美洛西林與相鄰雜質(zhì)的分離度均符合要求，系統(tǒng)的耐用性良好。

2.10 供試品測(cè)定 取供試品，照“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定。204批次樣品，按藥典標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，單個(gè)雜質(zhì)在0.19%～1.27%之間，均值為0.49%，總雜質(zhì)在0.44%～2.53%之間，均值為1.01%，雜質(zhì)個(gè)數(shù)在6～17之間，平均10個(gè)；按改進(jìn)后的方法檢驗(yàn)，單個(gè)雜質(zhì)在0.18%～1.45%之間，平均0.60%，雜質(zhì)總和在0.79%～3.35%之間，平均1.98%，雜質(zhì)個(gè)數(shù)在17～43之間，平均為30個(gè)。與藥典結(jié)果相比，改進(jìn)方法的雜質(zhì)總和及雜質(zhì)個(gè)數(shù)頁(yè)明顯高于藥典方法，部分企業(yè)單個(gè)雜質(zhì)變化較大，主要是因?yàn)楦倪M(jìn)方法中保留時(shí)間約為27 min的雜質(zhì)峰的影響，該雜質(zhì)在部分企業(yè)的產(chǎn)品中為最大雜質(zhì)，而在藥典方法中，這一雜質(zhì)峰無(wú)法檢出。部分供試品結(jié)果見表1。

表1 樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

ChP.2015方法主峰相對(duì)保留時(shí)間4倍以外仍有雜質(zhì)峰檢出，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，峰形變寬，易造成雜質(zhì)的漏檢。采用改進(jìn)的方法在保留時(shí)間27 min左右有一明顯的雜質(zhì)峰檢出，此雜質(zhì)在部分企業(yè)的樣品中為最大雜質(zhì)，從而導(dǎo)致樣品最大雜質(zhì)有較大的增加。專屬性研究表明，該雜質(zhì)在各種破壞條件下均無(wú)明顯增加，提示該雜質(zhì)由原料合成過(guò)程帶入，需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

結(jié)果分析表明，改進(jìn)后的方法單個(gè)雜質(zhì)、總雜質(zhì)及雜質(zhì)個(gè)數(shù)均明顯增加，提示改進(jìn)后的方法能更全面的檢出雜質(zhì)，從而更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。