王艷敏，王娜，于黎鑫，常征

(山東齊都藥業(yè)有限公司，山東 淄博 255400)

復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液由德國費森尤斯卡比有限公司原研開發(fā)，在臨床上用于腸外營養(yǎng)。復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液為15種氨基酸(丙氨酸、精氨酸、門冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、醋酸賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸)和2種二肽(甘氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酰-L-酪氨酸)制成的滅菌水溶液。醋酸為賴氨酸醋酸鹽引入，枸櫞酸作為pH調節(jié)劑。為保證產品質量，需對醋酸鹽和枸櫞酸鹽進行研究和控制。

目前該產品未收載入國外藥典，僅收載于《中國藥典》2020年版(二部)，但未對醋酸鹽和枸櫞酸鹽進行控制。現(xiàn)有的醋酸鹽和枸櫞酸鹽的檢測方法主要有高效液相色譜法[1-3]、滴定法[4-5]、紫外-可見分光光度法[6-7]、離子色譜法[8-9]等。滴定法最為常見和簡便，但該產品成分復雜，導致干擾嚴重。紫外-可見分光光度法通常需要配合衍生化法進行檢測，原研廠家德國費森尤斯卡比有限公司本品進口藥品注冊標準(JX20030306)中借助德國Boehringer Mannheim公司的試劑盒采用酶催化法對醋酸鹽和枸櫞酸鹽進行質量控制，但酶催化法存在操作復雜，測定結果誤差大等缺點。離子色譜法和高效液相色譜法更適合該產品的檢驗和控制，李盼盼等[10-11]對該產品的研究中分別采用高效液相色譜法控制醋酸鹽含量和離子色譜法控制枸櫞酸鹽含量，其中高效液相色譜法采用只控制了醋酸鹽一種成分，采集時間較長，流動相中使用的硫酸為強腐蝕性液體，配制時稱量操作較危險；而枸櫞酸鹽的控制需使用離子色譜儀，普適性較差。因此，我們在對該產品進行質量研究時，在寧洪鑫等[13]研究方法的基礎上進行方法優(yōu)化，建立合適的高效液相色譜法，控制醋酸鹽和枸櫞酸鹽含量，該方法采集時間大大縮短，節(jié)省了檢驗成本，并且流動相配制采用調節(jié)pH值法相較于稱量方法更加簡便和安全。經詳細的方法學驗證，該方法操作簡便、精密度好、準確度高，可用于復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中醋酸鹽和枸櫞酸鹽含量的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；CPA225D電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；FE20型pH計(梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥 醋酸對照品(批號：AL160809-18，純度：99.81%，Stanford Chemicals)、枸櫞酸對照品(批號：100396-201603，純度：100.0%，中國食品藥品檢定研究院)；復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：17060801、17060802、17060803)；硫酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為菲羅門Rezex ROA-Organic Acid H+(7.8 mm×300 mm，8 μm)；流動相：以水(用硫酸調節(jié)pH值至2.7，必要時可調節(jié)pH值使各峰能分離)為流動相；檢測波長：210 nm；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：60 ℃；進樣量：10 μL。各色譜峰之間分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白輔料溶液 按制劑處方配制不含枸櫞酸和賴氨酸醋酸鹽的溶液。

2.2.2 對照品溶液 分別取醋酸和枸櫞酸對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL中分別含醋酸約1.85 mg和枸櫞酸約1.25 mg的溶液，作為醋酸對照品貯備液和枸櫞酸對照品貯備液。從中各取適量，加水稀釋制成每1 mL中含醋酸約0.37 mg和枸櫞酸約0.25 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液。

另取醋酸對照品貯備液和枸櫞酸對照品貯備液各適量，加水稀釋制成每1 mL中含醋酸約0.37 mg和枸櫞酸約0.25 mg的溶液，作為醋酸對照品溶液和枸櫞酸對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密量取本品5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗 取空白溶劑水、空白輔料溶液、醋酸對照品溶液、枸櫞酸對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液，依法注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

試驗結果表明，在該色譜條件下，枸櫞酸鹽峰與醋酸鹽峰的保留時間分別在8.446 min和15.850 min左右，與制劑中的其他各成分峰不形成干擾，空白溶劑水也不干擾測定，專屬性試驗符合要求，結果見圖1。

2.4 檢測限和定量限試驗 取醋酸對照品溶液、枸櫞酸對照品溶液，加水逐步稀釋，并依法注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

當信噪比S/N不小于10時，確定此濃度為定量限，將定量限溶液進一步稀釋，以信噪比S/N≥3確定檢測限。試驗結果：醋酸鹽和枸櫞酸鹽的定量限分別為7.4 μg·mL-1和4.2 μg·mL-1，檢測限分別為1.85 μg·mL-1和1.0 μg·mL-1。

2.5 線性和范圍試驗 精密稱取醋酸和枸櫞酸對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL中含醋酸鹽約740 μg，枸櫞酸鹽約500 μg的混合溶液，作為混合對照品貯備液；從中分別精密量取3、4、5、6、7 mL，各置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系列線性溶液。分別依法進樣，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。醋酸鹽回歸方程為Y=589.26X-511.40(r=0.999 9)，枸櫞酸鹽回歸方程Y=1 069.3X+680.90(r=0.999 9)。試驗結果表明，醋酸鹽在222～518 μg·mL-1、枸櫞酸鹽在145.2～338.8 μg·mL-1的濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.6 重復性試驗 取本品，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，平行6 份。分別依法進樣，記錄色譜圖，按外標法計算醋酸鹽和枸櫞酸鹽的含量。6 次測量結果表明醋酸鹽的平均含量為3.68 mg·mL-1，RSD為0.17%；枸櫞酸鹽的平均含量為2.66 mg·mL-1，RSD為0.10%，結果表明該方法重復性良好。

2.7 準確度試驗 按復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液的處方，制備分別含賴氨酸醋酸鹽和枸櫞酸鹽處方量的80%、100%、120%濃度的混合溶液，分別依法進樣，記錄色譜圖。以峰面積計算醋酸鹽和枸櫞酸鹽的回收率，結果見表 1。

試驗結果表明，醋酸鹽的平均回收率為100.45%，RSD為0.44%；枸櫞酸鹽的平均回收率為99.96%，RSD為0.52%，符合驗證要求，該方法準確度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液室溫放置8 h，分別于0、2、4、6、8 h取樣，依法檢驗。試驗結果表明，混合對照品溶液室溫放置8 h，醋酸鹽及枸櫞酸鹽峰面積的RSD分別為0.46%、0.13%，溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性試驗 改變流速(±0.05 mL·min-1)、流動相pH值(±0.05)、色譜柱(不同批次)等色譜條件參數(shù)，評估醋酸鹽和枸櫞酸鹽含量測定結果的影響程度。試驗結果表明，改變流速、流動相pH值，醋酸鹽峰及枸櫞酸鹽峰與其他峰之間分離度變差；但換用不同批次的色譜柱，分離情況良好，故需嚴格控制流速、流動相pH值等參數(shù)，如測定過程中出現(xiàn)峰不能良好分離時，可適當調整流速、流動相pH值等，可使測定結果良好。

2.10 樣品測定 對3 批中試規(guī)模復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液樣品(批號：17060801、17060802、17060803)依法進行測定，結果見表 2。

表2 醋酸鹽和枸櫞酸鹽含量測定結果

3 討論

復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中成分較復雜，原研廠家采用試劑盒-酶催化法對醋酸鹽和枸櫞酸鹽進行質量控制，但操作較煩瑣，且測定結果誤差較大。其他均無采用同一檢測方法同時控制醋酸鹽和枸櫞酸鹽含量的參考文獻或研究。我們研究時，采用高效液相色譜法，氫型陽離子交換樹脂色譜柱等，建立合適的醋酸鹽和枸櫞酸鹽的檢測方法。經詳細全面的方法學研究，該方法操作簡單，測定結果準確度高，重復性好，可用于復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中醋酸鹽和枸櫞酸鹽的含量測定。