陳永香，楊夢(mèng)月，彭仁國(guó)，曹言言，訾聃

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 貴陽(yáng) 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

上皮性卵巢癌是常見的婦科腫瘤，全球每年有12.5萬患者死于卵巢癌，嚴(yán)重威脅女性患者的身心健康[1]，通常情況下疾病診斷時(shí)已為晚期，80%的患者出現(xiàn)播散性的瘤體形成[2]。目前，卵巢癌的治療主要是手術(shù)聯(lián)合化療，但多數(shù)患者在完成初級(jí)治療后復(fù)發(fā)[3]。2005年，Bapat等[4]率先發(fā)現(xiàn)卵巢癌干細(xì)胞(ovarian cancer stem cell，OCSC)，為卵巢癌的發(fā)生提供了新的理論依據(jù)。研究表明，除了OCSC外，卵巢癌中還存在具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞亞群[5]。腫瘤干細(xì)胞的研究中通常會(huì)選擇與干細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)作為觀察指標(biāo)，目前已知的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物有很多，如分化抗原簇133(cluster of differentiation 133，CD133)、分化抗原簇44(cluster of differentiation 44，CD44)、分化抗原簇117(cluster of differentiation 117，CD117)、乙醛脫氫酶1家族成員A1(aldehyde dehydroge-nase, ALDH1A1)、分化抗原簇326(cluster of differentiation 326，CD326)及分化抗原簇24(cluster of differentiation 24，CD24)等[6-9]，其中CD133、CD44在卵巢癌中較為常見[10-11]。卵巢癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，除與本身的因素相關(guān)，還與趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)相關(guān)[12]。趨化因子-12(C-X-C motif chemokine ligand-12 ,CXCL12)是CXCR4特異性配體，二者在發(fā)育中至關(guān)重要，但也參與了多種病理過程[13]。目前小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)介導(dǎo)基因沉默、腫瘤的免疫治療等對(duì)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的研究已很多[14]，但靶向阻斷CXCR4來探討其對(duì)OCSC特征影響方面的研究很少，因此，本研究擬通過檢測(cè)上皮性卵巢癌細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，并利用其靶向阻斷劑普樂沙福(AMD3100)處理卵巢癌細(xì)胞后，探究CXCR4對(duì)卵巢癌腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特征的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株和主要試劑 卵巢上皮癌細(xì)胞株(human ovarian cancer cell line-3, OVCAR-3)購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)中心，高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium , DMEM)，AMD3100(美國(guó)MedChemExpress)，全細(xì)胞裂解液(radio-Immunoprecipitation assay，RIPPA)，1 ∶500 CXCR4抗體(美國(guó)R&D)，1 ∶500 CD133(美國(guó)Abcam)，1 ∶100 CD44抗體(美國(guó)CST)。

1.1.2主要儀器 SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(蘇州金凈)，3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱和FRESCO 21低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo)，4 ℃、-20 ℃ BCD-190TMPK冰箱(青島海爾)，B20-TEKELX800UV酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特)，ECLIPSE TS100光學(xué)顯微鏡及LHS-H100P-1顯微照相系統(tǒng)(日本 Nikon)，PowerpacTMBasic電泳儀(美國(guó) BioRAD)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 常規(guī)利用DMEM培養(yǎng)基將OVCAR-3細(xì)胞置于5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為對(duì)照組(0 mg/L AMD3100處理)、低濃度組(10 mg/L AMD3100處理)及高濃度組(100 mg/L AMD3100處理)。

1.2.2Western blot試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期各組細(xì)胞，裂解各組細(xì)胞收取細(xì)胞總蛋白，分離蛋白后脫脂，室溫封閉2 h根據(jù)蛋白量剪切條帶后分別加CXCR4、CD44及CD133抗體孵育，4 ℃過夜，TBST漂洗后，分別加二抗室溫孵育2 h漂洗，加DAB顯色液，待陽(yáng)性區(qū)帶顯色清晰后拍照記錄。

1.2.3細(xì)胞懸浮成球?qū)嶒?yàn) 取對(duì)數(shù)期各組細(xì)胞，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后離心，去掉含血清的培養(yǎng)基，PBS清洗2次，干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將384懸滴板置于準(zhǔn)備好的6孔板頂上，將重懸液接種于384懸滴板中，過濾的去離子水800 μL吸移到每個(gè)邊界貯存器中，在每個(gè)6孔板孔中加去離子水4～5 mL，進(jìn)一步控制濕度；分別于加藥處理后第2天、第7天倒置顯微鏡計(jì)數(shù)直徑大于50 μm的懸浮球，計(jì)算并比較成球率(成球率=懸浮球/加入細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CXCR4蛋白的表達(dá)

低濃度組和高濃度組OVCAR-3細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)分別低于對(duì)照組，且高濃度組也低于低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果，B為蛋白表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與低濃度組比較，P<0.05。

2.2 CD133與CD44蛋白的表達(dá)

低濃度組和高濃度組OVCAR-3細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44蛋白表達(dá)均分別低于對(duì)照組，且高濃度組也低于低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果，B、C分別為CD133和CD44蛋白表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與低濃度組比較，P<0.05。

2.3 細(xì)胞懸浮成球能力

經(jīng)AMD3100處理后，OVCAR-3細(xì)胞接種第2天時(shí)，對(duì)照組、低濃度組及高濃度組的細(xì)胞成球比例比較、差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)OVCAR-3細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞懸浮成球的比例分別低于低濃度組和高濃度組，且低濃度組也低于高濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：A為細(xì)胞懸浮成球試驗(yàn)結(jié)果(10×)；B為腫瘤細(xì)胞懸浮成球比例的定量結(jié)果；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與低濃度組比較，P<0.05。

3 討論

卵巢癌是常見的婦科腫瘤，其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是卵巢癌患者死亡的原因[15]。CXCL12及其受體CXCR4在卵巢癌中高表達(dá)，并促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)展[16]，趨化因子是細(xì)胞運(yùn)輸、相互作用及腫瘤發(fā)展的重要介質(zhì)[12]，CXCR4與其特異性配體CXCL12結(jié)合后可激活CXCR4-CXCL12軸，增加了癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[17]。CXCR4在卵巢癌的高表達(dá)，為卵巢癌的治療提供了新的思考，由于卵巢癌由于卵巢癌的耐藥性和全身性副作用，傳統(tǒng)的卵巢癌化療方法受到限制，靶向治療在卵巢癌的治療中顯得尤為重要，AMD3100與CXCR4具有高度親和力[18]，利用這一特性，展開本研究。本研究結(jié)果顯示，CXCR4在上皮性卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，在利用AMD3100阻斷CXCR4后，CXCR4的表達(dá)降低，不同濃度對(duì)CXCR4表達(dá)的抑制也存在差異性。乳腺癌上皮循環(huán)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型譜分析提示，CXCR4、CD44陽(yáng)性的患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞最具有攻擊性，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、腫塊的大小及死亡的風(fēng)險(xiǎn)都更嚴(yán)重[17]。Garg等[19]利用AMD3100阻斷CXCL12可減緩胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)，并增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)；Erhart等[20]研究提示，所有研究的膠質(zhì)瘤球體始終具有分子標(biāo)記CD44/CD133陽(yáng)性的細(xì)胞群；有關(guān)結(jié)腸直腸癌的研究也證實(shí)遠(yuǎn)端邊緣富集CD133表達(dá)的患者，其復(fù)發(fā)率增加，無病生存率降低[21]。由此可以推斷，CXCR4、CD44及CD133都對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用。Rasti等[22]研究提示CXCR4可以作為腎癌靶向治療的診斷和標(biāo)記物；Abigail等[23]研究也顯示，CXCL12/CXCR4軸在子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞中可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)誘導(dǎo)蛋白激酶B磷酸化和活性；Blagden[24]研究表明腫瘤內(nèi)細(xì)胞亞群的異質(zhì)性參與了腫瘤耐藥性的發(fā)生；Landencn等[25]發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞亞群，其耐藥性更強(qiáng)，靶向治療時(shí)將使耐藥細(xì)胞對(duì)化療的厭惡更加敏感。因此，本實(shí)驗(yàn)通過靶向阻斷CXCR4后，CD44和CD133的表達(dá)與對(duì)照組相比，明顯降低，懸浮成球的結(jié)果也表明靶向阻斷CXCR4后上皮性卵巢癌的懸浮成球能力明顯下降。

綜上所述，在上皮性卵巢癌細(xì)胞中，CXCR4可促進(jìn)CD44和CD133的表達(dá)，靶向阻斷CXCR4可降低上皮性卵巢癌細(xì)胞的干細(xì)胞特征，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。