邵永紅，鄭曉敏，汪 磊，吳文帥，周 潔，陳嘉杰

深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，光電器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

熒光顯微成像已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究，然而由于光學(xué)衍射系統(tǒng)的限制，可達(dá)到的最小分辨距離約為200 nm．為提高光學(xué)系統(tǒng)分辨率，出現(xiàn)了一系列新型超分辨技術(shù)，如受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion, STED)熒光顯微技術(shù)、隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)和結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(structured illumination microscopy, SIM)[1-5]．STED技術(shù)將系統(tǒng)分辨率大幅提高至遠(yuǎn)高于衍射極限分辨率水平(幾十nm或更高)，但所需的高功率受激輻射耗盡激光對生物樣品(特別是活細(xì)胞)損傷較大，因此，不適于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像．STED技術(shù)必須使用特殊STED染料，這限制了樣品的范圍．STORM技術(shù)的橫向和軸向分辨率分別可達(dá)到高于20 nm和50 nm的水平，但重構(gòu)一幅超分辨圖像需要采集平均數(shù)萬張?jiān)紙D像，限制了成像速度．STORM技術(shù)還需要具有開關(guān)效應(yīng)的熒光探針，對染料要求較高，限制了其適用范圍．SIM技術(shù)可將成像分辨率提高近2倍，且不需要特殊染料和高功率激光，光學(xué)系統(tǒng)相對簡單，便于與其他系統(tǒng)兼容，成像速度快，有利于活細(xì)胞成像[6-7]．

在結(jié)構(gòu)光超分辨成像技術(shù)中，采用光柵投影或雙光束干涉形式，在樣品中產(chǎn)生強(qiáng)度正弦調(diào)制的結(jié)構(gòu)光圖案，利用結(jié)構(gòu)光與樣本頻譜的卷積作用，將不可探測的高頻信息轉(zhuǎn)化為可探測的低頻信息，通過相移算法重構(gòu)超分辨圖像．為了解這些已被混頻的高頻信息，需獲取不同相位下結(jié)構(gòu)光照明產(chǎn)生的熒光圖案，如在線性結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像中，相鄰兩幅結(jié)構(gòu)光圖案的相位差為2π/3，每個(gè)方向需要采集3幅熒光圖像，3個(gè)方向共需采集9幅熒光圖像，最終通過算法重構(gòu)出超分辨圖像，將分辨率提高2倍．然而，在這種結(jié)構(gòu)光調(diào)制方式下，為減小偽影，獲取高質(zhì)量的超分辨圖像，需要精確控制結(jié)構(gòu)光圖案的相移，大的相移誤差會導(dǎo)致解頻錯(cuò)誤而無法實(shí)現(xiàn)超分辨成像[8-10]．為了解決結(jié)構(gòu)光相移難的問題，研究提出虛擬結(jié)構(gòu)光技術(shù)．不同于傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光成像技術(shù)利用硬件進(jìn)行結(jié)構(gòu)光調(diào)制，虛擬結(jié)構(gòu)光可以通過后期軟件編程對熒光衍射圖像進(jìn)行結(jié)構(gòu)光調(diào)制，直接避免了相移誤差，同樣可以將分辨率提高2倍，并實(shí)現(xiàn)活體成像[11-13]．在視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)研究中，由于眼球運(yùn)動(dòng)不可避免，導(dǎo)致很難獲得這類動(dòng)態(tài)物體的高分辨率圖像．為滿足眼球運(yùn)動(dòng)的快速成像要求，研究通過將虛擬結(jié)構(gòu)光與行掃描成像系統(tǒng)結(jié)合以提高成像速度，獲得高分辨率的視網(wǎng)膜活體成像[14-16]．

對于具有一定厚度的易散射樣品，單光子過程的激發(fā)深度被限制在樣品表面以下幾十μm；隨著成像深度的增加，信噪比下降導(dǎo)致分辨率的顯著下降，限制了虛擬結(jié)構(gòu)光技術(shù)的超分辨能力．多光子效應(yīng)熒光成像具有穿透深度大、光損傷小和光漂白小等優(yōu)勢，已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要手段[17-18]．然而，由于雙光子過程的非線性響應(yīng)，導(dǎo)致激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)與發(fā)射點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)不能近似相等，因此，線性結(jié)構(gòu)光公式不能直接用于雙光子虛擬結(jié)構(gòu)光．

為同時(shí)提高成像深度與系統(tǒng)分辨率，本研究將多光子效應(yīng)與虛擬結(jié)構(gòu)光技術(shù)相結(jié)合，提出虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光超分辨成像方法，推導(dǎo)成像理論公式，模擬成像實(shí)驗(yàn)．結(jié)果證明，該方法能夠?qū)⒎直媛侍岣?.95倍，可用于高散射厚樣本的超分辨成像．

1 虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像原理

1.1 光學(xué)成像系統(tǒng)

虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像系統(tǒng)采用點(diǎn)掃描激發(fā)與面探測相結(jié)合光路，如圖1．飛秒激光器產(chǎn)生近紅外飛秒脈沖激光，為避免高功率激光反射回激光諧振器干擾鎖模，需在激光器后放置光隔離器．激光經(jīng)x-y軸振鏡掃描后到達(dá)管鏡，激發(fā)濾光片用于過濾激發(fā)光以外的干擾光，再以高數(shù)值孔徑物鏡聚焦至樣品，通過雙光子過程激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)由物鏡后進(jìn)入二向色鏡反射至發(fā)射濾光片，最后被面探測器采集．由于雙光子效應(yīng)，僅焦點(diǎn)處的樣本可被激發(fā)出熒光，從而減少了焦平面外的背景信號，提高了光學(xué)切片能力．

圖1 虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像系統(tǒng)光路示意圖Fig.1 The scheme of two-photon virtual structured illumination microscopy

1.2 虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像理論

通過點(diǎn)掃描將樣本逐點(diǎn)激發(fā)．由于存在物鏡衍射，每個(gè)激發(fā)點(diǎn)的激發(fā)光通過物鏡后，在焦面處被衍射成為一個(gè)艾里斑，因此，除物鏡焦點(diǎn)處的樣本被激發(fā)產(chǎn)生熒光外，焦點(diǎn)附近的樣本也被激發(fā)．在雙光子效應(yīng)中，熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度的平方成正比，因此，產(chǎn)生的熒光光強(qiáng)與激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的平方成正比．每個(gè)激發(fā)點(diǎn)激發(fā)出的熒光通過物鏡被面探測器(scientific complementary metal-oxide semiconductor, sCMOS)成像記錄，探測器不僅記錄到焦點(diǎn)處的樣本信息，也記錄到焦點(diǎn)外艾里斑內(nèi)的樣本信息，這為后期的超分辨提供可能．通過逐點(diǎn)掃描和逐幅記錄，可以獲得一系列點(diǎn)樣本的衍射斑圖．以上成像過程可表示為

imag(r,rs,rd)(n)=

(1)

其中， imag(r,rs,rd)(n)表示采集到的第n個(gè)衍射斑圖像；r為掃描位置坐標(biāo)；rs為樣本面坐標(biāo)；rd為成像面坐標(biāo)；hex(r)和hem(r)分別表示激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和發(fā)射點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，均由光學(xué)系統(tǒng)決定，且與光波長有關(guān)；s(r)表示樣本熒光團(tuán)分布．

為討論方便，以下以掃描點(diǎn)坐標(biāo)的橫坐標(biāo)x分量rx、rsx及rdx代替r、rs及rd進(jìn)行推導(dǎo). 將每張衍射斑圖都乘以相同的正弦條紋進(jìn)行調(diào)制，然后將所有像素相加后賦值給焦點(diǎn)位置，得到樣本的總衍射圖像，可表示為

(2)

(3)

其中，i(rx)為結(jié)構(gòu)光調(diào)制混頻后的總衍射圖像；p(rdx)為調(diào)制函數(shù)；k0為空間頻率；φ為相位．

將p(rdx)代入i(rx)得

(4)

其中， *是卷積運(yùn)算．在傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光成像中，調(diào)制函數(shù)的空間頻率受系統(tǒng)激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的限制，使結(jié)構(gòu)光超分辨技術(shù)最多可使分辨率提高2倍．由式(4)可見，在雙光子虛擬結(jié)構(gòu)光中，由于積分運(yùn)算，激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)與發(fā)射點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)位置顛倒，此時(shí)限制調(diào)制函數(shù)空間頻率的是發(fā)射點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)．在雙光子效應(yīng)中，激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的平方與發(fā)射點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)差異不大，可忽略其差異，因此，最終成像效果與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光成像技術(shù)相同．

以下對該混頻圖像進(jìn)行解頻并重建超分辨圖像．對式(4)進(jìn)行傅里葉變換得

I(k)={[P(k)OTFem(k) ]*S(k) }×

[OTFex(k)*OTFex(k)]

(5)

(6)

其中，k為頻域坐標(biāo)；P(k)、S(k)、 OTFex(k)和OTFem(k)分別為p(rx)、s(rx)、hex(rx)和hem(rx)的傅里葉變換．將式(6)代入式(5)得

[OTFex(k)*OTFex(k)]

(7)

為了能夠解出S(k)[OTFex(k)*OTFex(k)]、OTFem(k0)S(k-k0)[OTFex(k)*OTFex(k)]和OTFem(-k0)S(k+k0)[OTFex(k)*OTFex(k)]分量，需要建立3個(gè)相位方程，即

(8)

對應(yīng)的解頻公式為

(9)

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 Lena圖像模擬實(shí)驗(yàn)

為了定性驗(yàn)證雙光子虛擬結(jié)構(gòu)光超分辨成像效果，對Lena圖像進(jìn)行模擬成像．設(shè)置單位像素長度為40 nm，激發(fā)光波長為800 nm，樣品發(fā)射光波長為560 nm，數(shù)值孔徑(numerical aperture, NA)為1.4，則由瑞利判據(jù)可得到系統(tǒng)的最小分辨距離為

(10)

圖2為傳統(tǒng)雙光子與虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子的模擬成像Lena圖片．對圖2(a)的無衍射樣本圖像以雙光子點(diǎn)掃描形式進(jìn)行模擬成像，可得如圖2(b)的傳統(tǒng)雙光子衍射圖像；再對所得雙光子衍射斑圖像集按照虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光超分辨成像方法進(jìn)行混頻調(diào)制，可以得到混頻圖像．最后通過對該混頻圖像解頻并重建，得到更高分辨率的超分辨圖像，如圖2(c)．對比圖2矩形框內(nèi)的高頻條紋圖像可見，圖2(c)可以分辨這些條紋，而圖2(b)不能分辨，證明虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像具有超分辨的成像能力．

圖2 傳統(tǒng)雙光子與虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子模擬成像Lena圖片F(xiàn)ig.2 Simulated imaging of Lena picture for conventional two-photon microscopy and two-photon virtual SIM

2.2 熒光珠實(shí)驗(yàn)

為定量分析虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光超分辨成像能力，通過模擬實(shí)驗(yàn)對100 nm熒光珠進(jìn)行傳統(tǒng)雙光子與虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子成像對比研究．成像條件與Lena圖像實(shí)驗(yàn)相同．模擬得到的傳統(tǒng)雙光子圖像如圖3(a)．可見，無法分辨圖3(a)中實(shí)線段位置的熒光珠．以點(diǎn)掃描形式對樣本進(jìn)行虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像，即激發(fā)光斑每移動(dòng)1個(gè)位置，記錄1幅艾里斑圖像，得到一系列衍射斑圖；根據(jù)虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像方法，對衍射斑圖逐幅乘以相同的正弦條紋并積分進(jìn)行混頻調(diào)制；最后通過結(jié)構(gòu)光重建算法恢復(fù)出超分辨圖像，如圖3(b)．可見，虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像能夠?qū)D3(a)中實(shí)線段位置的熒光珠分開．為了定量描述分辨率能力，分別選擇了1個(gè)和3個(gè)相近的熒光珠，沿圖3(a)或圖3(b)中虛線段或?qū)嵕€段位置獲取強(qiáng)度分布，如圖3(c)和圖3(d)．由圖3(c)可見，單個(gè)熒光珠的半高寬分別為235 nm和120 nm，虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像將分辨率提高了1.95倍；為展示頻譜展寬效果，繪制相應(yīng)頻譜分布圖，如圖3(e)和圖3(f)，虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像實(shí)現(xiàn)了頻譜均勻拓寬．

圖3 傳統(tǒng)雙光子與虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子模擬成像100 nm熒光珠Fig.3 Comparison of resolution capability between conventional two-photon microscopy and two-photon virtual SIM by simulated imaging of 100 nm fluorescent beads

結(jié) 語

針對厚組織的高分辨率成像需求，提出虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像技術(shù)，設(shè)計(jì)該方法的光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，推導(dǎo)成像原理，建立虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光超分辨圖像的重構(gòu)算法，并通過模擬驗(yàn)證該方法有效．結(jié)果表明，虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像能夠?qū)鹘y(tǒng)雙光子成像分辨率提高1.95倍，對厚樣本的高分辨率成像具有重要意義．

盡管虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像可以避免精確控制相移的問題，但存在采集幅數(shù)多，成像速度慢的缺點(diǎn)．多點(diǎn)并行技術(shù)已經(jīng)成為提高成像速度的有效手段，因此，將來結(jié)合線掃描或多焦點(diǎn)掃描方案，可以提高成像速度，并降低數(shù)據(jù)量，有利于虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光超分辨圖像重構(gòu)算法的數(shù)據(jù)處理．在生物成像應(yīng)用方面，虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像具有成像深度大的優(yōu)勢，適于厚度較大生物樣品成像研究．通過結(jié)合線掃描或多焦點(diǎn)掃描技術(shù)，有望實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞動(dòng)態(tài)超分辨成像．虛擬結(jié)構(gòu)光照明雙光子熒光成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究方面具有良好應(yīng)用前景．