李杉杉劉新民*王 瓊

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國際合作中心/藥學(xué)院,四川 瀘州 646000； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

抑郁癥是一種復(fù)雜的疾病,臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)損傷癥狀,涉及多種身心癥狀[1],嚴(yán)重影響患者的健康。 而高達(dá)三分之一的抑郁癥患者對傳統(tǒng)抗抑郁藥[2]反應(yīng)不良。 因此,迫切需要開發(fā)更安全、更有效的抑郁癥治療方法,而動物模型是進(jìn)行發(fā)病機(jī)制研究及藥物開發(fā)的基礎(chǔ)手段。

慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredicted mild stress, CUMS)模型是常見的研究抑郁癥的模型,其理論依據(jù)為動物處于不適宜生存的環(huán)境時會出現(xiàn)緊張、焦慮和抑郁等癥狀,而長期、慢性、不可預(yù)計(jì)的刺激可以加快抑郁癥的發(fā)展。 最初的形式是慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredicted stress,CUS),由Katz 等[3]在20 世紀(jì)80 年代初對此模型進(jìn)行了一系列研究,后來Willner 等[4]在此基礎(chǔ)上發(fā)展了慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型(CUMS)。CUMS 抑郁模型具有高度的有效性,并可持續(xù)幾個月,基本符合抑郁模型的要求,是目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中廣泛使用的模型[5-6]。 在臨床前研究中也得到了廣泛的應(yīng)用,有良好的表現(xiàn)、結(jié)果和預(yù)測效度,具有模擬病因的有效性。 本文通過查閱CNKI 和PubMed 兩大常用數(shù)據(jù)庫的相關(guān)文獻(xiàn)資料,對10 年來慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激進(jìn)行了歸納和整理,從造模動物、CUMS 模型刺激因子、造模時長等方面進(jìn)行總結(jié),為CUMS 模型在抑郁癥研究中的使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

使用CNKI 和PubMed 兩大常用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

CUMS 相關(guān)文章發(fā)表的研究調(diào)查利用CNKI 的中國學(xué)術(shù)文獻(xiàn)網(wǎng)絡(luò)出版總庫進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。 點(diǎn)擊“高級搜索”,在“主題搜索”中輸入“CUMS”,同時應(yīng)用“并含”輸入“大鼠”,時間設(shè)定為2010 年1 月1日-2020 年4 月30 日,檢索有關(guān)大鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方面的中文文獻(xiàn)；同樣的在“主題搜索”中輸入“CUMS”,同時應(yīng)用“并含”輸入“小鼠”,檢索有關(guān)小鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方面的中文文獻(xiàn)。 用PubMed 以“CUMS”為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,檢索同樣時間段的慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激相關(guān)的英文文獻(xiàn)。 當(dāng)研究符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)時被計(jì)為有效文獻(xiàn):(1)以原始文章的形式發(fā)表的期刊,會議文章、綜述剔除；(2)實(shí)驗(yàn)中有空白組和模型組,并且模型組只使用了CUMS 模型；(3)造模時長以及刺激因子描述完整；(4)使用了行為學(xué)檢測,并且有行為學(xué)結(jié)果；(5)動物品系、雌雄描述清楚,使用未轉(zhuǎn)基因或未接受產(chǎn)前應(yīng)激或絕育的嚙齒動物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過匯總所有納入研究的文獻(xiàn),全文閱讀審查所要研究的數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)相關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)并計(jì)算占比。圖形由GraphPad Prism 5, GraphPad Software 提供。

2 結(jié)果

2.1 CUMS 相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表情況

獲得CUMS 相關(guān)的中英文文獻(xiàn)共有1755 篇,其中有關(guān)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方面的中文文獻(xiàn)共有1076 篇(大鼠788 篇,小鼠288 篇),有關(guān)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激相關(guān)的英文文獻(xiàn)共有679 篇。對這1755 篇論文進(jìn)行全文評估后,發(fā)現(xiàn)有效文獻(xiàn)共有679 篇,其中英文文獻(xiàn)有424 篇,中文文獻(xiàn)有255篇。 有效文獻(xiàn)中CUMS 大鼠模型492 篇,CUMS 小鼠模型187 篇。 有效文獻(xiàn)中進(jìn)行藥效學(xué)研究的有420 篇,其中CUMS 大鼠模型292 篇,CUMS 小鼠模型128 篇。 具體分布情況如圖1。 可見每年發(fā)表文獻(xiàn)逐年上升,其中2018 年及2019 年發(fā)表文獻(xiàn)最多。

2.2 CUMS 模型建立的調(diào)查結(jié)果

2.2.1 CUMS 模型動物的選擇

從圖2A 可見,95.3%的CUMS 造模都選擇雄性鼠。 有文獻(xiàn)報道雄性大鼠對慢性應(yīng)激更敏感[7],但也有文獻(xiàn)認(rèn)為慢性應(yīng)激更易致雌性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為[8],同時還有文獻(xiàn)報道慢性應(yīng)激對不同性別的大鼠所致的抑郁樣行為沒有差異[9]。

關(guān)于大小鼠的選擇,84.4%的研究選擇了大鼠,選擇小鼠的只有15.6%。 對于大鼠,除了個別實(shí)驗(yàn)使用到Charles-Foster、Long-Evans 和GK 大鼠,大部分使用了SD、Wistar 大鼠(圖2B),而有文獻(xiàn)稱Wistar 大鼠較SD 大鼠更敏感[10]。 對于小鼠,除了個別實(shí)驗(yàn)使用到NMRI 和CD-1 小鼠,大部分使用了C57BL/6、昆明、ICR、BALB/c、Swiss 小鼠(圖2C)。其中,BALB/c 小鼠屬于敏感小鼠,C57BL/6 屬于不敏感小鼠[10]。

2.2.2 CUMS 刺激因子的選擇與使用情況

在CUMS 造模過程中,刺激因子的多變性、不可預(yù)見性是模型成功的關(guān)鍵,單獨(dú)使用一種刺激不能產(chǎn)生理想的效果,每種刺激因子應(yīng)間隔3 ～7 d[11]。具體的CUMS 造模中刺激因子及其使用情況如圖3所示。

圖1 CUMS 相關(guān)文獻(xiàn)按年份的分布情況Figure 1 Distribution of CUMS related literature by year

從圖3A 可見,68.5%的CUMS 造模過程都選擇了7～9 種刺激因子,只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)選擇了≥12 或≤6 種的刺激因子,最少的用了5 種[12],最多的用了15 種[13]。

從圖3B 可見,使用頻率排前十的刺激因子依次為禁水、禁食、潮濕墊料、冰水游泳、籠傾斜、夾尾、束縛、晝夜顛倒、持續(xù)照明、水平振蕩。 大小鼠使用頻率排前十的刺激因子是一樣的,只是排序有差異。 圖3B 羅列的是使用頻率大于10%的刺激因子,圖3C 羅列的是使用頻率小于10%的刺激因子。除此之外,還有部分少見的刺激因子,如腹腔注射生理鹽水、從高處落下、高臺刺激、白光照射、交換鼠籠、強(qiáng)光照射等。

(1)飲食和飲水供應(yīng)的調(diào)整

禁食、禁水是最常見的刺激因子,因其操作簡單而刺激強(qiáng)度較大。 實(shí)驗(yàn)中的禁食有三種類型:單獨(dú)禁食(77.6%)、禁食禁水同時進(jìn)行(20.7%)、禁食后限制進(jìn)食(1.7%)；禁水也有三種類型:單獨(dú)禁水(75.4%)、禁食禁水同時進(jìn)行(20.5%)、禁水后空瓶(4.1%)。 禁食的刺激時長85.5%為24 h[14],8.1%為12 h[13],8.1%為48 h[15]。 禁水的刺激時長80.5%為24 h[14],8.2%為12 h[15],值得注意的是禁水與潮濕墊料一般不同時進(jìn)行,因?yàn)槌睗駢|料中有水。 禁食禁水的刺激時長一般為24 h[16],而禁食禁水后控制飲食時長一般為禁食或禁水23 h 后限制進(jìn)食或空瓶1 h[17]。 空瓶刺激是一種將水倒掉只留瓶子在鼠籠上的一種應(yīng)激方式,在使動物體感饑渴的同時,更能使動物焦慮,約80%的刺激時長為1 h[18]。

注:A:動物性別使用占比；B:大鼠品系使用占比；C:小鼠品系使用占比。圖2 CUMS 模型中動物的性別、品系使用情況Note. A, The usage proportion of animal sex, B, The usage proportion of rat strain, C, The usage proportion of mouse strain.Figure 2 The usage of animal sex and strain in CUMS model

(2)居住環(huán)境的改變

居住環(huán)境改變常見的有配對、擁擠、鼠籠傾斜、潮濕墊料,少見的有單籠飼養(yǎng)[17]和空籠[14]。 在配對或擁擠刺激中,常見的是將兩只原本單籠飼養(yǎng)的動物放置在同一個鼠籠中,也有實(shí)驗(yàn)者將多于2 只動物放置在一個籠子,刺激時長一般為12 h[19]或24 h[13]。 鼠籠傾斜的角度一般為45°,也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)中選擇30°[20]或60°[21]。 對于傾斜45°而言,刺激時長多數(shù)為24 h[14],少數(shù)為12 h[17]。 潮濕墊料的一般操作方式為,將200 mL 水倒入裝有100 g 墊料的鼠籠中,約60%的刺激時長為24 h[13],少數(shù)為12 h[19]。 另外,籠傾斜與潮濕墊料常被運(yùn)用到同一個實(shí)驗(yàn)內(nèi),有時甚至同時應(yīng)用[22]。

注:A:CUMS 模型中刺激因子使用量；B:常見的刺激因子(使用頻率10%～100%)；C:常見的刺激因子(使用頻率1%～10%)。圖3 CUMS 模型中刺激因子的使用情況Note. A, The number of stimulating factors in CUMS model. B, Popular stimulation factors (frequency 10%～100%). C, Popular stimulation factors(frequency 1%～10%).Figure 3 Usage of stimulating factors in CUMS model

(3)晝夜節(jié)律的重新調(diào)整及光照性質(zhì)改變

常見的有晝夜顛倒、持續(xù)照明、頻閃,少見的有間歇光照、黑暗應(yīng)激[20]和白光照射[20]。 頻閃頻率一般為60 ～150 次/分[17],時長一般為12 h[23]并且在夜間進(jìn)行。 晝夜顛倒操作即為白天關(guān)燈12 h,夜晚開燈12 h[14]。 持續(xù)照明多數(shù)為通宵持續(xù)照明[16]。 間歇照明較少見,一般持續(xù)10 ～24 h,大部分是以2～3 h 為一個循環(huán)[23],少數(shù)是以1 h 為一個循環(huán)[13]。

(4)游泳

游泳一般有冷水游泳,熱水游泳,強(qiáng)迫游泳三種應(yīng)激方式。 冷水游泳主要是使實(shí)驗(yàn)鼠接受冷的刺激,大部分為在4℃～6℃的水中游泳5 min[13]。熱水游泳主要是使實(shí)驗(yàn)鼠接受熱的刺激,大部分為在40℃～45℃的水中游泳5 min[13]。 而單純的強(qiáng)迫游泳主要是使動物疲勞,一般為在20℃～25℃[24]水中游泳幾分鐘至1 h 不等。 實(shí)驗(yàn)中常用的應(yīng)激因子是前兩種。

(5)溫度調(diào)整

溫度變化一般分為高溫刺激或低溫刺激。 高溫環(huán)境刺激是將實(shí)驗(yàn)鼠移至溫度比較高的房間或烘箱中,溫度一般為42℃～50℃,刺激時長一般為5～15 min[19]。 值得注意的是高溫環(huán)境刺激與熱水游泳一般不在實(shí)驗(yàn)中同時出現(xiàn)。 低溫刺激即將房間溫度調(diào)至0℃～5℃,刺激時間一般為1～2 h[19]。

(6)其余應(yīng)激方式

夾尾是將夾子夾在實(shí)驗(yàn)鼠尾巴上使其疼痛的一種應(yīng)激方式,多數(shù)實(shí)驗(yàn)選擇夾在距離尾根1 cm處,應(yīng)激時長一般為1 ～3 min[16]。 束縛是限制動物活動的一種應(yīng)激方式。 應(yīng)激時長一般為1 ～6 h,44.2%的實(shí)驗(yàn)束縛2 h[14]。 水平振蕩是將動物放置在鼠籠中,使用手動或機(jī)器的方式使其在水平面高速振蕩的一種應(yīng)激方式。 刺激時間多為5 ～15 min,頻率在60～160 rpm 之間[14-15]。 噪音干擾一般有4種:捕食者聲音,一般使用時間為30 min[25]；超聲[26]應(yīng)激時長為1～24 h 不等；白色噪音,分貝一般在60～120 dB[17],使用時間一般為1 ～12 h；以及實(shí)驗(yàn)鼠尖叫聲[20]。 前三者較常見,而最后一種刺激少見。 電擊常用短時間電擊足底[26]、少數(shù)采用電擊耳朵[22]。 常用的強(qiáng)度為1 ～15 mA,60 ～70 V,一般每次電擊5～10 s,間隔10～50 s,共15～30 次。 陌生異常物體如塑料杯、勺子、碎布片等在鼠籠中放置,會使動物產(chǎn)生焦慮和恐懼,應(yīng)激時長一般為24 h[24]。懸尾刺激是使動物處于倒懸位的一種刺激方式,應(yīng)激時長一般為1 ～5 min[24]。 氣味刺激的應(yīng)激時長一般為1～3 h[16,27]。

2.2.3 CUMS 造模時長及每日刺激次數(shù)的使用情況

如圖4A 所示,造模3～4 周占大部分(58.8%),造模時間最短為11 d,每天給予2 種刺激因子[28],造模時間最長為14 周,每天給予一種刺激因子[29],還有少數(shù)為分段造模[18]。 從圖4B 可見,95.5%的CUMS 造模過程,每天都只安排1 ～2 種刺激因子[23],少數(shù)實(shí)驗(yàn)者采用每天3 ～4 種刺激因子[19]。造模時長為3 ～4 周的實(shí)驗(yàn)中,81.8%每天給予1 種刺激因子,2.6%每天給予3 ～4 種刺激因子；造模時長為5～8 周的實(shí)驗(yàn)中,60.5%每天給予1 種刺激因子,9.2%每天給予3～4 種刺激因子。

對于造模后,研究抑郁狀態(tài)的持續(xù)時長的文章,統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)共有66 篇。 其中研究造模3 周后抑郁持續(xù)時間的文章最多,共31 篇,4 周的次之,有20篇。 給予刺激因子3～4 周后,撤出刺激因子后抑郁可以持續(xù)3 ～4 周[14,30],有些甚至持續(xù)5 周[31]。 可見撤出刺激因子后抑郁狀態(tài)持續(xù)時長可與刺激時長持平,甚至長于刺激時長。

2.3 CUMS 行為學(xué)檢測的研究調(diào)查

圖5 是大小鼠都會使用到的行為學(xué)檢測的使用頻次排序。 我們可以看出,在實(shí)驗(yàn)中用到糖水偏好實(shí)驗(yàn)(SPT)的頻率最高,其次有曠場實(shí)驗(yàn)(OFT)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)、懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)、水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPM)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)(NSFT)等行為學(xué)檢測。 除此之外,少數(shù)小鼠用到輻射臂迷宮實(shí)驗(yàn)、嗅覺鑒別實(shí)驗(yàn)、嗅覺靈敏度實(shí)驗(yàn)、巴恩斯迷宮、高架零迷宮測驗(yàn)、社會交互實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)測試。 少數(shù)大鼠用到機(jī)械痛覺過敏實(shí)驗(yàn)、熱痛覺過敏實(shí)驗(yàn)、被動回避實(shí)驗(yàn)、熱板實(shí)驗(yàn)、跳臺實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)測試。

注:A:CUMS 造模時長分布圖；B:每日刺激數(shù)使用占比。圖4 CUMS 模型中造模強(qiáng)度使用情況Note. A, Distribution of modeling duration in CUMS model, B, Usage proportion of daily stimulating factors.Figure 4 Usage of modeling strength in CUMS model

圖5 CUMS 模型中行為學(xué)測試使用頻率分布圖Figure 5 Frequency distribution of behavioral tests in CUMS model

CUMS 抑郁模型主要模擬了人類抑郁的核心癥狀——快感缺失。 統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在大小鼠中最常用的行為學(xué)檢測都是糖水偏好實(shí)驗(yàn),糖水偏愛指數(shù)作為測量CUMS 抑郁模型快感缺乏的有效客觀指標(biāo)。 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)既是應(yīng)激性抑郁動物模型的造模方法,也是抑郁動物模型常用的檢測方法；而曠場實(shí)驗(yàn)可用于評價各類應(yīng)激性抑郁動物模型的自主運(yùn)動行為、探究行為和緊張度,從而反映抑郁程度。 此4 種行為學(xué)檢測使用頻率都大于10%。值得注意的是懸尾實(shí)驗(yàn)共使用了141 次,其中小鼠108 次(在小鼠中使用頻率為57.8%)、大鼠33 次(在大鼠中使用頻率為6.7%)。 而運(yùn)用到強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)中,只有3.0%使用到了強(qiáng)迫游泳這種刺激因素。 CUMS 不僅可以導(dǎo)致抑郁,也可導(dǎo)致認(rèn)知障礙與焦慮,所以部分實(shí)驗(yàn)也用到了水迷宮實(shí)驗(yàn)與高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。

不同的行為學(xué)檢測出現(xiàn)顯著性差異的時間不同。 糖水偏愛實(shí)驗(yàn)[32]和曠場實(shí)驗(yàn)[32]最早為1 周,強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[33]、懸尾實(shí)驗(yàn)[33]與高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)[34]最早為2 周,水迷宮實(shí)驗(yàn)[19]與新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)[25]最早為3 周。

3 討論

長期不良事件刺激與抑郁癥的發(fā)生有明確關(guān)系,且不良事件越多,抑郁癥的發(fā)生率越高[35]。CUMS 模型可以模擬生活中的不同應(yīng)激源,使得動物產(chǎn)生抑郁癥狀,與人類患抑郁癥的歷程有相似性。 本文綜述了造模動物、CUMS 模型刺激因子、造模時長,希望為今后CUMS 造模提供一些參考:(1)雄性大鼠的使用頻率較高,若無特殊要求可以選擇雄性大鼠；(2)為了使動物不可預(yù)知刺激,刺激因子選擇7 ～9 種比較合適,3 ～7 d 內(nèi)不重復(fù),但如果實(shí)驗(yàn)條件允許,也可以選擇更多的刺激因子；(3)幾乎實(shí)驗(yàn)中都會出現(xiàn)禁食禁水、冰水游泳、潮濕墊料、籠傾斜、光照節(jié)律改變,再搭配一些其他刺激因子；(4)建議每天選擇1 ～2 種刺激因子；(5)造模長度選擇3～4 周比較合適,如果是先造模后給藥,可以采用造模與給藥時間等同；(6)大小鼠都可以使用糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),如果是小鼠也可以使用懸尾實(shí)驗(yàn),而進(jìn)行認(rèn)知與焦慮方面的研究可以考慮水迷宮實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。