鐘齊健， 金婷婷， 彭毓， 陳偉雄， 李勁松

1.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）口腔科，廣東 深圳（518106）； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市龍崗中心醫(yī)院口腔科，廣東 深圳（518116）; 3.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 廣州（510120）

舌鱗狀細胞癌是最常見的口腔癌。盡管近年來影像診斷、外科治療、放射治療和化學(xué)治療等方面取得了長足進步，但舌鱗狀細胞癌患者的5 年生存率僅略有提高［1-2］。舌鱗狀細胞癌的具體發(fā)病機制尚未完全闡明，因此揭示舌鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的具體機制并提供相應(yīng)的治療策略十分重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的細胞器，在蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制中起著至關(guān)重要的作用［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的不斷積累所引起的，而未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）則可以減少轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的蛋白質(zhì)數(shù)量，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)位和增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力以保護細胞免受過于強烈的ERS 反應(yīng)［4］。ERS 可以引起多種應(yīng)激蛋白的表達上調(diào)，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose-regulated protein 94，GRP94）、鈣結(jié)合伴侶凝集素calnexin 和Calreticulin以及底物特異性伴侶蛋白等［5］。ERS 蛋白在許多腫瘤類型中都有上調(diào)，包括結(jié)直腸癌［6］、乳腺癌［7］、肺癌［8］、肝癌［9］和前列腺癌［10］等。目前公認的ERS信號通路包括蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R -like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核翻譯起始因子2a（eukaryotic translation initia-tion factor 2a，eIF2a）-轉(zhuǎn)錄激活子4（activating tran-scription factor 4，ATF4）- C/EBP 同源蛋白（C/EBP homoiogousprotein，CHOP）、肌醇酶1（inositol-requir-ing enzyme 1，IRE1）-CHOP、轉(zhuǎn)錄激活子6（activat-ing transcription factor 6，ATF6）-CHOP 這3 條［11］。在口腔癌中，有文獻報道其中一個ERS 相關(guān)蛋白calnexin 表達上調(diào)［12］。在大規(guī)模組織標(biāo)本篩選發(fā)現(xiàn)舌鱗狀細胞癌中calnexin 較癌旁組織高表達，而近期發(fā)現(xiàn)calnexin 可控制線粒體的位置和呼吸鏈反應(yīng)［13］。結(jié)合本課題組前期在線粒體動力學(xué)的研究基礎(chǔ)［14］，筆者通過干預(yù)ERS 蛋白calnexin 的表達以檢測舌鱗狀細胞癌細胞的生物學(xué)功能變化，包括細胞增殖、侵襲和遷移，以揭示calnexin 蛋白在舌鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

舌鱗狀細胞癌細胞系SCC-9 和SCC-25 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collec-tion，ATCC）；DMEM-F12（Gibco，美國）；胎牛血清（BI，以色列）；calnexin 干擾序列和對照序列（蘇州吉瑪基因股份有限公司，中國）；RNA 提取試劑Trizol（Life Technologies，美國）；Lipofectamine 3 000（Invitrogen，美國）；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa，日本）；calnexin 和內(nèi)參GAPDH 引物（蘇州泓迅生物科技有限公司，中國）；蛋白酶抑制劑（Solarbio，中國）；RIPA 緩沖液（Sigma，美國）；calnexin 蛋白多克隆兔抗人抗體（Abcam，英國）；GAPDH 蛋白抗體、羊抗兔二抗（Proteintech，中國），CCK-8 試劑（Dojindo，日本），Transwell 小室及基質(zhì)膠（Corning，美國）。實時熒光定量PCR 儀（LightCycler 480，Roche，德國）；WB曝光機（Mini Chemi 610，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，中國）；酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，蘇州賽恩斯儀器有限公司，中國）；相機（BX63，Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞SCC-9 和SCC-25。培養(yǎng)條件：體積分數(shù)5% CO2，37 ℃，飽和濕度。隔天換液1 次，待細胞鋪滿瓶底時傳代。按轉(zhuǎn)染試劑盒說明對對數(shù)生長期細胞進行轉(zhuǎn)染，分為calnexin 對照序列組（NC）和干擾組（si-CNX），其中實驗證實si-CNX1 和si-CNX2 能夠有效敲低calnexin 的表達，NC 和si-CNX 序列如下表1。

表1 Calnexin 對照序列和干擾序列Table 1 Calnexin control and interference sequences

1.2.2 采用qRT-PCR 檢測calnexin 表達 各組細胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 后，用細胞裂解液裂解，提取總RNA，并用紫外分光光度計檢測總RNA 純度。將總RNA 用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以引物序列為模板，用實時熒光定量PCR 儀擴增。引物序列如下表2。根據(jù)制造商的說明，qRT-PCR 是使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（ReverTra Ace，Toyobo）和LightCycler 480（Roche，Basel，Switzer-land）進行的。對照組的相對表達水平設(shè)為1，各組樣品設(shè)3 個復(fù)孔，采用2-△△Ct法對細胞中calnexin 表達量進行計算。

表2 qRT-PCR 引物序列Table 2 Sequences of the qRT-PCR primers

1.2.3 蛋白提取以及Western blot 實驗 用PBS 沖洗細胞5 min，一共3 次。加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液。在4 ℃下將細胞溶解0.5 h，刮下樣品并在4 ℃下以12 000 rpm 的速度離心20 min，收集上清液作為總蛋白。蛋白質(zhì)提取物通過8%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，用抗人calnexin 抗體（濃度1∶2 000）、GAPDH 抗體（濃度1∶2 000），在4 ℃冰箱中孵育過夜，然后與過氧化物酶結(jié)合的二抗結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光觀察條帶，分析條帶的灰度值。

1.2.4 細胞增殖實驗 經(jīng)過轉(zhuǎn)染實驗后，收集細胞并按10 000 個細胞/孔種入96 孔板中。所有的細胞都培養(yǎng)24 h 后使用CCK 8 試劑測定1、2、3、4、5 d的活細胞數(shù)。檢測前去除每個孔的培養(yǎng)基，添加10 μL CCK 8和90 μL DMEM/F12的混合物，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h后，用酶標(biāo)儀測量A450 nm處的吸光度值。1.2.5 Transwell 法檢測細胞遷移能力 各組細胞培養(yǎng)24 h 后進行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染24 h 后，將溶于200 μL無血清培養(yǎng)基中的2×104個SCC-9 和SCC-25細胞分別接種于8 mm 直徑的Transwell 小室中，24孔板下室加入含10% 胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基，37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2細胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。各小室用棉簽去除細胞懸液，PBS 沖洗2 次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機挑選5個視野拍照計數(shù)穿膜細胞。

1.2.6 Transwell 法檢測細胞侵襲能力 取基質(zhì)膠，4 ℃解凍后用無血清培養(yǎng)液稀釋，平鋪于Transwell小室上室，過夜風(fēng)干備用。其余步驟同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P ＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA 干預(yù)calnexin 基因表達

qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，SCC-9 和SCC-25 細胞的干擾組si-CNX1 和si-CNX2 中calnexin mRNA 表達量較NC 組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖1a）。Western blot 結(jié)果也顯示SCC-9 和SCC-25 細胞的干擾組si-CNX1 和si-CNX2 中calnexin 蛋白表達量下降（圖1b）。

2.2 沉默calnexin 對細胞增殖能力的影響

與NC 組相比，si-CNX1 和si-CNX2 組SCC-9 細胞的增殖速度在第4 天減慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），在第5 天增殖速度進一步減慢（圖2a，P ＜0.001）；在SCC-25 細胞中si-CNX1 和si-CNX2 組增殖速度也是在第4 天（P ＜0.01）和第5 天較NC組減慢（圖2b，P ＜0.001）。

2.3 沉默calnexin 對細胞侵襲和遷移能力的影響

與NC 組相比，si-CNX1 和si-CNX2 組SCC-9 細胞的侵襲和遷移能力減弱（圖3a），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.001）；同樣，與NC 組相比，si-CNX1 和si-CNX2 組SCC-25 細胞的侵襲和遷移能力也減弱（圖3b），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.001）。

Figure 1 Expression of calnexin in tongue squamous cell carcinoma cells transfected with siRNA圖1 Calnexin siRNA 轉(zhuǎn)染舌鱗狀細胞癌細胞后calnexin 的表達

Figure 2 Knockdown of calnexin inhibited the proliferation of tongue squamous cell carcinoma cells圖2 沉默calnexin 基因能夠抑制舌鱗狀細胞癌細胞的增殖

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成的重要細胞器，功能包括跨膜和分泌性蛋白質(zhì)折疊、脂質(zhì)生物合成、藥物解毒、鈣儲存和信號傳導(dǎo)等。在穩(wěn)定狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊機制可以輕而易舉滿足腫瘤細胞的需求。然而，如果錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累超過可耐受的閾值，未折疊蛋白反應(yīng)將被觸發(fā)以提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊能力。如果未折疊蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)失敗，細胞將會走向凋亡［15］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腫瘤中普遍存在，與腫瘤進展和化療耐藥密切相關(guān)，耐受持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的能力增強了腫瘤細胞的生存和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)在舌鱗狀細胞癌中同樣存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且線粒體分裂在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中具有重要的調(diào)控作用［14］。近期又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白calnexin 可以控制線粒體位置和呼吸鏈反應(yīng)［13］。在本研究中，沉默calnexin 的表達可抑制舌鱗狀細胞癌的增殖、侵襲和遷移能力，揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在舌鱗狀細胞癌進展中具有關(guān)鍵作用。

鈣是一種參與蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)折疊、細胞存活和死亡信號傳導(dǎo)等過程的常見信號分子，它儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中受到鈣結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Calreticulin 和calnexin 的調(diào)節(jié)。calnex-in 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的I 型整合膜蛋白，具有輔助蛋白質(zhì)折疊、監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊質(zhì)量和調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用［16］。一項肺癌患者隊列研究的結(jié)果提示calnexin 可能是肺癌血清診斷標(biāo)志物［17］。此外，calnexin 蛋白水平可能成為5FU 化療Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者不良臨床預(yù)后的一個新指標(biāo)。體外研究進一步證實calnexin 對結(jié)直腸癌細胞生長增殖的重要性，也證明了下調(diào)calnexin 的表達可以提高結(jié)直腸癌對5FU 化療的敏感性［18］。沉默calnexin 基因可顯著抑制胃癌細胞的增殖和提高細胞凋亡率［19］。孫為增等［20］在腎母細胞瘤中的研究提示沉默calnexin 可促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過激活JNK 通路從而促進腫瘤細胞的凋亡。用calnexin 中和抗體下調(diào)calnexin 的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的增殖以及乳腺癌細胞和肝癌細胞的肺轉(zhuǎn)移均被抑制［21］。因此，calnexin 可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響腫瘤細胞的生物學(xué)功能。

Figure 3 Knockdown of calnexin inhibited the invasion and migration of tongue squamous cell carcinoma cells圖3 沉默calnexin 基因能夠抑制舌鱗狀細胞癌細胞的侵襲和遷移

研究者發(fā)現(xiàn)calnexin 在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達顯著上調(diào)，而且calnexin 的高表達與口腔鱗癌患者預(yù)后不良呈正相關(guān)，其具體機制可能與免疫逃逸有關(guān)［12］。Alam 等［22］發(fā)現(xiàn)支架基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白1（scaffold matrix attachment region binding protein1，SMAR1）通過下調(diào)calnexin 促進腫瘤細胞表面主要組織相容性復(fù)合體1（major histocompati-bility complex 1，MHC I）的表達升高，抑制腫瘤的增長。然而，上述研究側(cè)重于從免疫學(xué)角度探究calnexin 的功能和具體機制，并未揭示calnexin 的直接生物學(xué)功能。在本研究中，通過siRNA 敲低cal-nexin 的表達，并在mRNA 水平和蛋白水平證實了calnexin 的沉默效果。CCK8 實驗結(jié)果提示下調(diào)calnexin 的表達能夠抑制舌鱗狀細胞癌細胞的增殖，Tranwell 實驗則證實沉默calnexin 的表達能夠顯著抑制舌鱗狀細胞癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。cal-nexin 可能是舌鱗狀細胞癌新的治療靶點。

【Author contributions】 Zhong QJ performed the experiments，ana-lyzed the data，and wrote the article. Jin TT，Peng Y revised the arti-cle. Chen WX，Li JS designed the study. All authors read and ap-proved the final manuscript as submitted.